近年来，侵袭性念珠菌病、曲霉菌病等机会性真菌感染日益增多，且致病真菌的种类也不断增加。真菌血症的临床诊断比较困难，常规血培养阳性率低、耗时长；而检测真菌循环抗原(体)、特异性酶和代谢产物的血清学方法则存在特异性和敏感性低的缺陷。由于真菌血症等系统性真菌感染的死亡率高，加之近来发现的几种非白念珠菌感染的致病菌具有对常规抗真菌药物的天然耐受性，因此，及早将致病菌鉴定到种对于指导临床应用合适的抗真菌药物进行治疗具有非常重要的意义。 本文建立了PCR结合反向斑点杂交技术鉴定医学重要真菌的分子生物学方法。PCR扩增临床常见真菌DNA所用的通用引物P4501、P4502是根据真菌的ERG11基因而设计的，用此引物扩增念珠菌属和新型隐球菌DNA，扩增片段的长度为300-350bp。对扩增产物进行序列分析，表明此序列与基因库中提供的序列基本一致，同源性高达99.6％。引物之一P4501在5′端标记生物素，其PCR产物用于反向杂交分析。此通用引物不扩增其它临床常见的细菌、病毒和人类细胞的DNA分子；且PCR反应可检测出100fg的真菌DNA或10个真菌细胞。因而具有很好的特异性和敏感性。 由于白念珠菌感染占临床真菌感染的50％左右，我们应用复合PCR技术可以首先将白念珠菌鉴定出来。白念珠菌特异性引物和上述真菌通用引物同时扩增提取的真菌DNA，如为白念珠菌，则电泳图谱可显示出2条DNA带，其长度分别为300bp(通用引物扩增产物)，779bp(白念特异性引物扩增产物)。如果只出现通用引物扩增的一条带，再通过反向杂交进行种的鉴定。复合PCR技术可一步区分出白念珠菌和非白念珠菌的致病真菌，节省了人力、物力，并为临床治疗争取了时间。军事医学科学院硕士论文中文摘要 ERGll基因是高度保守的，但其中也存在可变区。种特异性寡核昔酸探针即是根据这些区域设计的，本研究合成了8种临床常见致病真菌的特异性探针:白念珠菌探针(pCal)、热带念珠菌探针(pTro)、克柔念珠菌探针(pKru)、光滑念珠菌探针(pGla)、季也蒙念珠菌探针(pGui)、近平滑念珠菌探针 (PPar)、新型隐球菌探针(pCry)，和近年来新发现的都柏林念珠菌探针 (pDub)。用此8种特异性探针对PCR产物进行反向斑点杂交，可将致病真菌鉴定到种的水平。试验结果表明，此8种探针不与其它种的真菌、细菌和人类DNA分子杂交，此方法具有高度的特异性。 利用PCR一反向斑点杂交法对112例各种临床标本进行检测分析，经与常规的培养鉴定方法(A Pl ZOC)相比较，其中107例两种方法鉴定结果完全一致，另5例中的3例PCR结果为阳性，但PCR扩增产物与上述8种探针的杂交反应均为阴性，表明是上述8种真菌以外的致病真菌，临床培养鉴定的结果为无名念珠菌 (2例)和乳酒念珠菌(1例);其余2例血液标本PCR一反向斑点杂交法结果为阳性，常规培养法为阴性。常规血培养方法约需3一6个工作日才能将致病菌鉴定到种，而本方法则只需1一2天即可，如经大量临床标本尤其是血液和脑脊液标本的检测验证，可望成为一种快速、敏感、特异的诊断方法。 为将PCR一反向杂交技术更好地应用于临床，我们初步探讨了PCR结合微孔板反向杂交的检测方法。这一方法具有比斑点杂交更为快速和简便的优点，并且具有自动化的潜能。试验结果表明，微孔板杂交的敏感性和特异性与斑点杂交相当，且容易操作，可以进行大量临床标本的检测，非常适合在临床实验室开展。