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心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)每年导致全球范围内约1,700万人死亡,预计到2030年会增加到23,600万,已经成为危害人类健康的头号杀手。其中缺血性心脏病(ischemic heart disease)在2010年导致全球约700万患者死亡,比1990年增加了35%。心肌细胞凋亡以及心脏成纤维细胞增殖分化、心肌纤维化,导致了以心室重构为病理基础的心力衰竭是缺血性心脏病患者的主要死亡原因。基于心肌细胞凋亡以及心肌纤维化导致的一系列严重后果,探讨其发生发展机制、研究和寻找防治的新靶点和有效药物是目前亟待解决的医学难题,日益受到国内外心血管专家的重视。微小RNA(microRNAs, miRNAs)是在进化过程中高度保守的、约22个核苷酸构成的、内源性非编码RNA分子,通过抑制靶分子mRNA(messenger RNA)的翻译或促进其降解在转录后水平调节了其表达,参与了机体多种生理和病理的过程。miR-208家族由miR-208a, miR-208b和miR-499组成,分别由α-心肌肌球蛋白重链基因(a-cardiac muscle myosin heavy chain gene, α-MHC/Myh6),β-心肌肌球蛋白重链基因(B-cardiac muscle myosin heavy chain gene, β-MHC/Myh7)和Myh7b基因编码,在调节肌球蛋白含量、肌纤维密度和肌肉性能方面起着至关重要的作用。研究表明,miR-208a在心肌组织中特异性表达,miR-208b和miR-499可在心肌和骨骼肌中表达。在动物中研究发现,上调miR-208a能够诱导心室肥厚,纤维化和心功能不全,而下调miR-208a的表达可以逆转胸主动脉结扎,高盐饮食和心肌缺血等应激诱导的心室肥厚,心肌纤维化以及保护心功能。临床研究发现,血清或血浆中异常升高的niR-208a是早期诊断急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)的生物学标志物之一。但是,迄今为止,miR-208a对应激条件下心肌细胞凋亡的影响以及miR-208a诱导心肌纤维化的机制尚不明确?Nemo-like kinase (NLK)是进化上内源性保守ERK-2/MAPK样激酶,广泛分布于机体各组织器官。NLK可通过磷酸化或泛素化等机制调节多种信号通路的关键分子,在细胞增殖、迁徙和凋亡等方面具有重要功能。通过查询miRbase数据库发现,NLK的3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)在序列上和1niR-208a互补结合,是miR-208a潜在的靶分子之一。但是,miR-208a能否通过靶向抑制NLK调控心肌凋亡以及心脏成纤维细胞值分化目前尚不清楚。因此,本课题探讨以下内容：首先,在体建立大鼠AMI后心肌细胞凋亡和纤维化模型,采用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白印记技术(western blot)观察内源性miR-208a和NLK在AMI后的表达变化。其次,在体外培养的H9C2心肌细胞中,研究miR-208a在血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)诱导的心肌细胞凋亡过程中的功能。采用荧光素酶报告基因(luciferase reporter assay)实验确定NLK是否为miR-208a调节细胞凋亡的靶蛋白之一,并进一步探讨NLK在心肌细胞凋亡过程中的作用和机制。最后,在原代心脏成纤维细胞,研究miR-208a和NLK调控心脏成纤维细胞增殖分化的功能和机制。研究的结果如下：1.miR-208a在AMI后表达增加,NLK表达减少大鼠AMI后出现明显的心肌细胞凋亡和心肌间质纤维化。HE染色见模型组心肌细胞出现明显的坏死及炎性细胞浸润,梗死区周围心肌细胞肥大；心脏成纤维细胞增生,假手术组心肌细胞基本正常。TUNEL染色发现模型组非梗死区心肌细胞凋亡比例明显增多。Western blot检测发现,模型组抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达增加。Masson染色见模型组非梗死区心肌间质胶原容积增加,Western blot检测发现模型组a-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)和Ⅰ型胶原蛋白表达较假手术组明显增加。qRT-PCR检测发现,模型组心肌miR-208a表达较假手术组明显升高。原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)发现模型组心肌细胞胞浆内miR-208a表达增加,其中以梗死区周围心肌细胞明显。模型组NLK mRNA及蛋白表达均较假手术组明显减少。免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色提示模型组非梗死区心肌细胞浆内NLK表达较明显降低。体内研究表明：异常表达的miR-208a和NLK可能参与了心肌细胞凋亡和心肌纤维化的进程。2. Ang Ⅱ上调H9C2细胞miR-208a表达,并诱导其凋亡在体外采用不同浓度的Ang Ⅱ(0,50,100和200 nM)刺激H9C2心肌细胞24h,qRT-PCR检测发现miR-208a表达呈浓度依赖性上调,并在Ang Ⅱ(100 nM)干预24h时达到高峰。采用Ang Ⅱ(100 nM)干预H9C2细胞24h,流式细胞术(flow cytometry, FCM)发现Ang Ⅱ组细胞凋亡的比例较空白对照组增加。Western blot检测发现Ang Ⅱ降低了抗凋亡蛋白Bcl-2水平,升高了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表达,提示上调的miR-208a可能与H9C2细胞凋亡相关。3.上调miR-208a促进Ang Ⅱ诱导的H9C2细胞凋亡在体外分别进行细胞转染miR-208a mimics, inhibitors和各自对照物8h后,再以Ang Ⅱ (100 nM);刺激H9C2细胞24h,采用FCM检测发现miR-208a mimics(200nM)组细胞调亡的比例较对照组明显增加,miR-208a inhibitors (200nM)组细胞凋亡比例明显减少。Western blot检测发现,miR-208a mimics组NLK蛋白和抗调亡蛋白Bcl-2表达明显减少,而miR-208a inhibitors组NLK蛋白和抗调亡蛋白Bcl-2表达显著增加。以上结果提示,miR-208a可能通过抑制NLK和Bcl-2蛋白表达促进Ang Ⅱ诱导的H9C2细胞凋亡。4.NLK是miR-208a促进心肌细胞凋亡的有效靶分子之一为了验证NLK是否是1miR-208a的靶蛋白,采用细胞转染miR-208a mimics, inhibitors和各自对照物8h。Western blot发现miR-208a mimics (200nM)组NLK蛋白表达下调,而1miR-208a inhibitors (200nM)组NLK蛋白表达上调。荧光素酶检测发现,共转染miR-208a mimics (200nM)和NLK-WT能够抑制NLK的荧光活性,而共转染miR-208a inhibitors (200nM)和NLK-WT能够上调NLK的荧光活性。5.NLK调控AngⅡ诱导的H9C2细胞凋亡为了明确NLK调节心肌细胞凋亡的机制和功能,在体外分别进行siRNA-NLK和pcDNA3.1(+)-NLK细胞转染实验。转染siRNA-NLK 8h,再以AngⅡ(100nM)干预H9C2细胞24h。Western blot发现siRNA-NLK组的NLK和Bcl-2蛋白表达较对照组明显下调；FCM检测发现siRNA-NLK组细胞凋亡的比例增加,提示下调NLK促进了AngⅡ诱导的细胞凋亡。转染pcDNA3.1(+)-NLK过表达质粒8h,再以Ang Ⅱ(100 nM)干预H9C2细胞24h。Western blot发现pcDNA3.1(+)-NLK组的NLK和Bcl-2蛋白表达较对照组明显上调；FCM检测发现,pcDNA3.1(+)-NLK组细胞凋亡比例减少,提示上调NLK抑制了AngⅡ诱导的细胞凋亡。6.上调miR-208a促进AngⅡ诱导的心脏成纤维细胞的增殖和分化在体外培养的原代大鼠心脏成纤维细胞研究发现,不同浓度的Ang Ⅱ(0,50,100和200 nnM)刺激细胞24h,miR-208a表达呈浓度依赖性上调。Western blot检测发现a-SMA蛋白水平也呈浓度依赖性增加。在体外分别转染miR-208a mimics和mimics control 8h,再以AngⅡ(100nM)干预心脏成纤维细胞24h。Western blot检测发现miR-208a mimics (200nM)组a-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组明显升高,FCM分析发现miR-208a mimics (200nM)组心脏成纤维细胞的增殖比例也升高。在体外分别转染-208a inhibitors和inhibitors control 8h,再以Ang Ⅱ(100 nM)干预心脏成纤维细胞24h。Western blot检测发现miR-208a inhibitor (200nM)组a-SMA和Ⅰ型胶原蛋白水平较对照组下降,FCM分析发现miR-208a inhibitors(200nM)组心脏成纤维细胞增殖明显减少。该结果提示：miR-208a促进心脏成纤维细胞的增殖分化,这可能是miR-208a促进心肌纤维化的重要原因之一。7.下调NLK抑制心脏成纤维细胞的增殖和分化在心脏成纤维细胞中分别转染siRNA-NLK和siRNA control 8h, Ang Ⅱ (100nM)干预24h。qRT-PCR和western blot检测发现Ang Ⅱ上调NLK mRNA和蛋白表达,siRNA-NLK组NLK mRNA和蛋白表达显著降低。Western blot检测发现siRNA-NLK组a-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达减少,FCM分析发现,siRNA-NLK组心脏成纤维细胞增殖较对照组明显降低,抑制NLK减少了心脏成纤维细胞的增殖分化。