研究背景和目的肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)是多种间质性肺疾病的最终转归,其发病机制复杂,虽然存在吸烟、药物暴露、感染、环境等多种的危险因素,但大多数肺间质性疾病的病因及特异性的分子及细胞机制是不清楚或不确定的。PF病死率高,目前尚无有效治疗手段,因此,寻求一种有效的治疗策略迫在眉睫。近来研究发现,在博莱霉素(bleomycin, BLM)气管内滴入致大鼠PF模型中,EGFR的mRNA水平明显上升。Madtes等也发现BLM引起小鼠PF病变与EGFR表达上调有关,EGFR突变的小鼠不容易发生PF,提示EGFR的高表达可能参与了PF的发生发展。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI),主要针对受体酪氨酸激酶活性区域,可阻扰EGFR信号下传。吉非替尼是其代表药物之一,目前临床上主要用于非小细胞肺癌的分子靶向治疗。虽然既往有报导其代表药物吉非替尼有增加PF的风险,但最新的日本吉非替尼Ⅱ期临床试验结果公布的吉非替尼PF发生率与单纯接受其他化疗药物相差不大,提示吉非替尼可能不是直接导致PF的原因。本课题组前期研究中使用大剂量吉非替尼灌胃亦未见导致小鼠PF。另一方面,William等对TNF-α转基因小鼠PF的研究表明,吉非替尼可明显抑制因EGFR活化而导致的PF形成,并可以部分逆转已形成的纤维化病灶。Rho等[9]发现EGFR-TKI敏感性下降的肺泡上皮细胞向间充质细胞转分化,说明EGFR参与PF中上皮-间质转分化。BLM引起小鼠PF的主要机制是引起局部的氧化损伤,因此,我们推测EGFR-TKI抑制小鼠PF过程可能与氧化应激的减轻有关。氧化／抗氧化的失衡是PF重要发病机制之一。相关研究报导EGFR的磷酸化可通过活化下游的细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,Erk1/2)信号通路及人转录激活因子-1(ATF-1)途径上调NADPH氧化酶(NADPH Oxidase, Nox)表达,加剧体内氧化损伤。氧化物质的大量生成除引起直接的氧化损伤外,也能通过降低酪氨酸磷酸酯酶的活性抑制EGFR的降解,从而活化Akt[12]、Erk1/2等信号通路,正反馈促进Nox的表达。可见,氧化损伤与EGFR之间存在相互作用的环路,共同促进肺结构细胞异常增生、分化及细胞外基质沉积。目前抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸的安全性及有效性已得到临床公认,但是单药NAC治疗有限,且往往需要大剂量使用或与激素或细胞毒性药物联用,无法避免激素或细胞毒性药物的毒副作用,因此如何更好使用抗氧化剂治疗也是当前PF研究中的热点。基于氧化损伤与EGFR的表达是PF中的相互作用两个关键节点,我们推测,抑制EGFR的活化,能降低氧化应激,减轻异常活化及PF过程；而联合吉非替尼与抗氧化剂NAC从PF的两个关键节点同时进行干预,进一步加强抗氧化治疗,则能最大程度上起到遏制PF的作用。本研究采用MicroSprayer雾化器气道内雾化的方式优化BLM诱导小鼠PF模型,研究EGFR-TKI吉非替尼对BLM诱导的PF小鼠肺组织的保护效应及对氧化相关基因的影响,并在此基础上进一步探讨吉非替尼联合NAC对小鼠PF的作用及机制。研究方法1MicroSprayer雾化器气道内雾化给药优化BLM诱导小鼠PF模型小鼠随机分为3组,BLM气管内雾化(BLM intratracheal aerosol inhaled,ITA)组小鼠采用MicroSprayer雾化器雾化BLM溶液,BLM气管内滴入(BLM Intratracheal injection,ITI)组小鼠分离暴露气管后从气管内滴入BLM溶液(3mg/kg,100μL),对照组小鼠不予处理,于第14天收集样本。小鼠开胸取肺,计算小鼠肺系数(肺湿重/体质量×100)；比色法检测肺组织羟脯氨酸(hydroxyproline,HYP)含量；将肺组织置于10%中性甲醛固定48h后,石蜡包埋、切片行HE和Masson染色,参照Mikawar[13]和Ashcroft[14]法对肺病理损伤和纤维化程度进行评分。另取小鼠同期用伊文斯蓝代替BLM进行气管内雾化与滴入,5分钟后取肺观察伊文斯蓝在肺内的分布。2吉非替尼下调BLM诱导的氧化应激水平气管内雾化BLM溶液复制小鼠PF模型,小鼠分为对照组、BLM组及BLM+吉非替尼组。BLM组与BLM+吉非替尼组小鼠气管内雾化BLM溶液(3mg/kg,100μL),对照组雾化与BLM溶液等体积的生理盐水。BLM+吉非替尼组在BLM处理后予吉非替尼(20mg/kg/d,200μ)灌胃。14d后取样检测。测量肺系数。检测组织HYP含量。肺组织冲洗后福尔马林固定,石蜡包埋切片行HE和Masson染色,对肺组织损伤和纤维化程度进行评分。肺组织匀浆后抽提总蛋白,Western Blot检测肺组织p-EGFR表达。留取小鼠血清,检测血清内丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)。3吉非替尼联合NAC对BLM诱导PF小鼠肺组织的保护效应及对氧化相关基因的影响气管内雾化BLM复制小鼠PF模型,小鼠分为对照组、BLM组、BLM+NAC组、BLM+吉非替尼组和BLM+NAC+吉非替尼组。各模型组小鼠气管内雾化等量BLM溶液(3mg/kg,100μL),对照组雾化与BLM溶液等体积的生理盐水。BLM雾化处理后,各组每天对应给予NAC (3mmol/kg,100μL)或(和)吉非替尼(20mg/kg,200μ)灌胃。比色法检测血清MDA含量和T-AOC;肺组织匀浆后抽提总RNA, PCR检测肺组织Nox1/2/4基因转录强度变化；肺组织匀浆后抽提总蛋白,Western Blot检测肺组织Noxl/2/4蛋白表达。4吉非替尼联合NAC对BLM诱导PF小鼠肺组织EGFR/Akt及MAPKs通路的影响气管内雾化BLM复制小鼠PF模型,分组处理同上。肺组织匀浆后抽提总蛋白,Western Blot检测EGFR及其下游Akt、Erk1/2、p38和JNK的磷酸化程度。结果1MicroSprayer雾化器气道内雾化给药优化BLM诱导小鼠PF模型1.1ITA组与ITI组小鼠在BLM处理后,肺组织HYP含量较对照组显著增高(P均<0.001),ITA组小鼠肺组织HYP含量高于ITI组(P=0.020)。1.2ITA组小鼠各肺叶组织结构均有不同程度的破坏,在单一肺叶中肺结构破坏相对较轻；ITI组小鼠部分肺叶组织结构破坏严重,肺泡结构无法辨认,部分肺组织结构相对完整,肺叶之间病灶不均匀：对照组小鼠肺叶结构完整,无明显破坏。ITA组与ITI组小鼠在BLM处理后,肺损伤评分较对照组显著增高(P均<0.001),而ITA组与ITI组小鼠肺损伤评分间差异无统计学意义(P=0.244)。ITI组小鼠不同肺叶间病理损伤程度不一(P=0.016),而ITA组小鼠不同肺叶间病理损伤评分差异无统计学意义(P=0.446)。1.3ITA组小鼠各肺叶均有不同程度的纤维化表现,蓝染区域弥散；ITI组小鼠部分肺叶内纤维化显著,镜下可见大片蓝染区域,呈片状、斑片状分布,蓝染区域内肺组织正常结构消失；对照组小鼠肺内有少量纤维化,主要分布于大气道周围。BLM处理后,ITA组与ITI组小鼠肺组织纤维化评分显著高于对照组(P均<0.001),而ITA组与ITI组小鼠肺组织纤维化评分差异无统计学意义(P=0.686)。ITI组小鼠不同肺叶间纤维化程度不一(P=0.038),而ITA组小鼠不同肺叶间纤维化评分差异无统计学意义(P=0.290)。1.4ITA组与ITI组小鼠在伊文斯蓝处理后,可见ITA组小鼠伊文斯蓝溶液呈点状或斑片状分布于各肺叶,而ITI组小鼠伊文斯蓝溶液分布区域比较集中,呈块状分布。2吉非替尼下调BLM诱导的氧化应激水平2.1BLM组小鼠肺组织HYP含量显著高于对照组(P<0.001),吉非替尼处理后,小鼠肺组织HYP含量较BLM组明显降低(P=0.016)。2.2BLM组小鼠肺组织病理损伤纤及维化程度评分均显著高于对照组(P<0.001),吉非替尼处理后,小鼠各项评分较BLM组均明显降低(P=0.001,P=0.003)。2.3BLM组小鼠肺组织p-EGFR表达显著高于对照组(P<0.001),吉非替尼处理后,小鼠肺组织p-EGFR表达较BLM组明显降低(P<0.001)。2.4BLM组小鼠血清MDA含量显著高于对照组(P=0.010),血清T-AOC较对照组明显降低(P=0.001),吉非替尼处理后,小鼠血清MDA含量较BLM组明显降低(P=0.002),血清T-AOC较BLM组升高(P=0.002)。3吉非替尼联合NAC对BLM诱导PF小鼠肺组织的保护效应及对氧化相关基因的影响3.1BLM组小鼠肺组织HYP含量显著高于对照组(P<0.001),NAC、吉非替尼和NAC+吉非替尼处理后,小鼠肺组织HYP含量较BLM组明显降低(P均<0.001)。BLM+NAC+吉非替尼组HYP含量较BLM+NAC组及BLM+吉非替尼组降低(P均<0.05)。3.2博来霉素组小鼠肺组织病理损伤及纤维化程度评分均显著高于对照组(P<0.001), NAC、吉非替尼及NAC联合吉非替尼处理后,小鼠各项评分较BLM组均明显降低(P均<0.01)。BLM+NAC+吉非替尼组评分较BLM+NAC组及BLM+吉非替尼组明显降低(P均<0.05)。3.3BLM组小鼠血清MDA含量明显高于对照组(P<0.001),T-AOC明显低于对照组(P=0.001)。NAC、吉非替尼与NAC+吉非替尼处理后,小鼠血清MDA含量较BLM组显著降低,T-AOC较BLM组显著回升(P均<0.05),BLM+NAC组、BLM+吉非替尼组与BLM+NAC+吉非替尼组三组组间MDA及T-AOC比较差异无统计学意义。3.4BLM组小鼠肺组织内Nox1/2/4基因表达水平均明显高于对照组(P均<0.01)。吉非替尼与NAC+吉非替尼处理后,小鼠肺组织Nox1/2/4基因表达较BLM组均显著降低(P均<0.01),且NAC+吉非替尼联合处理较吉非替尼处理Nox4基因表达降低(P=0.029), BLM+吉非替尼组与BLM+NAC+吉非替尼组两组间Noxl/2基因表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)。NAC处理后Nox1/2/4基因表达较BLM组差异无统计学意义(P均>0.05)。3.5BLM组小鼠肺组织Nox1/2/4蛋白表达水平明显高于对照组(P均<0.01)。吉非替尼与NAC+吉非替尼处理后,小鼠肺组织Nox1/2/4蛋白表达水平较BLM组显著降低(P均<0.05),且NAC+吉非替尼联合处理较吉非替尼处理Nox4蛋白表达降低(P=0.012),BLM+吉非替尼组与BLM+NAC+吉非替尼组两组间Noxl/2蛋白表达比较差异无统计学意义(P均>0.05)。NAC处理后Nox4蛋白的表达水平较BLM组显著降低(P=0.001), Nox1/2蛋白表达较BLM组差异无统计学意义(P均>0.05)。4吉非替尼联合NAC对BLM诱导PF小鼠肺组织EGFR/Akt及MAPKs通路的影响4.1BLM组小鼠肺组织p-EGFR表达明显高于对照组(P<0.001),吉非替尼与NAC+吉非替尼处理后,小鼠肺组织p-EGFR较BLM组比较显著降低(P均<0.001),两处理组组间比较差异无统计学意(P=0.338)。NAC处理后p-EGFR表达较BLM组比较差异无统计学意义(P=0.161)。4.2BLM组小鼠肺组织p-Akt表达明显高于对照组(P<0.001)。NAC、吉非替尼与NAC+吉非替尼处理后,小鼠肺组织p-Akt较BLM组比较显著降低(P均<0.05)。NAC与NAC+吉非替尼处理两组组间比较差异无统计学意义(P=0.385),且p-Akt水平均较吉非替尼处理降低(P均<0.05)。4.3BLM组小鼠肺组织p-Erk1/2、p-p38及p-JNK表达均明显高于对照组(P均<0.01)。NAC、吉非替尼与NAC+吉非替尼处理后,小鼠肺组织p-Erk1/2、p-p38及p-JNK表达较BLM组比较均显著降低(P均<0.05),且NAC+吉非替尼联合处理较吉非替尼处理p-Erk1/2表达降低(P=0.005),BLM+吉非替尼组与BLM+NAC+吉非替尼组两组间p-p38及p-JNK表达差异无统计学意义(P均>0.05)。NAC处理后p-Erk1/2表达水平较BLM组显著降低(P=0.004),p-p38及p-JNK表达较BLM组差异无统计学意义(P均>0.05)。结论吉非替尼和吉非替尼联合NAC均可抑制EGFR及其下游信号表达,降低氧化相关基因Nox的表达,减轻氧化应激,减缓肺结构细胞的损伤、异常修复及胶原的沉积,且两药联合较单药更显著抑制Nox4的表达,减轻氧化损伤,从而最大程度上遏制PF的发生、发展,为未来PF治疗药物的研发提供了一条靶向性更强、副作用更少、更安全有效的新思路。