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目的:目前已有上百种疾病证实或怀疑与线粒体DNA(mtDNA)突变有关。由于缺乏线粒体疾病动物模型的制作方法导致包括病因在内的线粒体疾病的研究受到极大的限制,因此探索动物模型的制作方法已成为线粒体疾病研究的当务之急。转线粒体小鼠的出现为人类线粒体疾病动物模型的开发提供了新思路,可以利用线粒体转移技术,将含有突变mtDNA的线粒体引入小鼠受精卵,来制备动物模型。mtDNA突变的线粒体可从两种方式获得:(1)根据mtDNA的易突变性,使用理化因素处理健康人血液或细胞得到含有突变mtDNA的线粒体;(2)从线粒体疾病患者血液或组织细胞中提取线粒体。本研究为人类线粒体动物模型的制备开展了以下一些基础性的研究工作:(1)检测γ射线和苯诱导线粒体基因组D-loop区突变的情况,探讨射线和苯对mtDNA的损伤作用以便得到含有突变mtDNA的线粒体;(2)研究小鼠线粒体基因组D-loop区新型R-loop时空表达的状况,了解R-loop的生物功能及与生长发育衰老等的关系;(3)利用显微注射法将人线粒体引入小鼠受精卵细胞,进行胚胎移植,产出仔鼠后检测人mtDNA,从而建立人小鼠嵌和体动物模型并探讨mtDNA的组织分布及遗传规律。
材料与方法:
(1)将健康成人外周血分4组,各10mL,分别进行0、15、25、35Gy剂量的γ射线照射,吸收剂量率0.5~12Gy/min。差速离心法分离线粒体,动物细胞基因组DNA提取试剂盒提取mtDNA,PCR扩增D-loop区,进行测序,与标准和对照序列做比对,得到D-loop的突变结果。
(2)SPF级昆明雌性小鼠20只,18~22g,空白对照组10只,苯染毒组10只。处死小鼠取股骨冲出骨髓细胞,动物组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA,PCR扩增D-loop区,进行测序,与对照序列做比对,得到D-loop的突变结果。
(3)半定量RT-PCR和Northern-blot检测小鼠不同发育时期在不同组织R-loop的表达状况。
(4)差速离心法分离线粒体,电镜观察线粒体形态结构,试剂盒检测线粒体标志酶(琥珀酸脱氢酶)活性,PCR、PCR-RFLP和测序法鉴别人、小鼠mtDNA D-loop区基因的差异。
(5)差速离心和蔗糖梯度法提纯线粒体,胞浆显微注射法将线粒体引入小鼠受精卵,胚胎移植,产出仔鼠应用PCR、PCR-RFLP和测序法检测人mtDNA。
结果:
(1)经不同剂量γ射线照射后,在D-loop区总共发现25个点突变,8个缺失突变,5个插入突变;在C组,4号样品发生了5碱基(ACCCT)连续插入突变,插入位点在16246 nt。不同剂量的γ射线照射后,D-loop区的突变频率不同。从总体来看,C组(25Gy)突变频率高于B组和D组,B组(15Gy)突变频率居中,D组(35Gy)最低。
(2)在3只苯中毒模型小鼠D-loop区总共发现6个点突变,2个缺失突变,3个插入突变。
(3)卵子、2-cell胚胎、囊胚、10d胚胎和2月龄小鼠线粒体DNA上都有R-loop的表达,表达量随着小鼠月龄的增加而增高。在小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏和脑组织中均有R-loop的表达,组织不同,表达量也各不相同。2月龄小鼠各组织R-loop的表达量高于24h新生小鼠相应组织。
(4)透射电镜下可见线粒体大小不一,部分线粒体结构完整,部分线粒体呈空泡状,内部结构受到破坏。分离后的线粒体标志酶(琥珀酸脱氢酶)活性增高。用相同的引物分别扩增人和小鼠的mtDNA D-loop区出现了长度不同的扩增片段,以人基因组DNA为模板所扩增片段的长度为591bp,以小鼠基因组DNA为模板所扩增片段的长度为482bp。对这两个片段进行测序,所得序列与人和小鼠mtDNA D-loop区序列一致。以人为模板扩增的片段内含有KpnⅠ限制性内切酶酶切位点,能将PCR产物酶切成3个小片段;以小鼠为模板扩增的mtDNA片段内无KpnⅠ酶切位点,因此不能产生短片段。
(5)对获得的小鼠进行检测,结果显示1只雌性小鼠在482bp和591bp处均出现条带,而其他小鼠只在482bp处出现条带。对PCR产物进行RFLP分析发现这只雌性小鼠可以被KpnⅠ酶切,其他小鼠PCR产物不能被酶切。PCR及PCR-RFLP结果说明雌性小鼠含有人mtDNA。对扩增的591bp片段进行测序,测序结果证实与人mtDNA D-loop区序列相同。
(6)阳性雌鼠与野生C57BL/6J雄鼠交配后产下G1代仔鼠,对其进行PCR发现,所有仔鼠均只在482bp处出现单一条带,证实无人mtDNA存在。
(7)检测人mtDNA在阳性小鼠不同组织(心脏、肝脏、脑组织、肾脏、脾脏、骨骼肌组织)的分布状况发现,在脾脏组织中出现了591bp条带,其他组织未出现,说明人mtDNA在脾脏中有表达,而在其他组织中未发现有表达。
结论:
(1)高剂量γ射线辐照健康成人外周血细胞后,mtDNA D-loop区突变增多,并且射线诱发的某些突变位点及类型与线粒体相关疾病的突变位点及类型一致。不同个体的生物辐射敏感性不同-不同剂量射线对不同个体的mtDNA D-loop区损伤程度不同。
(2)苯能诱发骨髓细胞mtDNA D-loop区突变;苯中毒诱导的不同个体的D-loop区损伤的严重程度不同。
(3)R-loop结构的表达水平随着小鼠的发育成熟而逐渐增高,说明与小鼠胚胎发育、成熟和老化相关。
(4)R-loop在成年小鼠不同组织中的表达水平不同,说明与器官组织的结构和功能有关。
(5)成功建立了转入线粒体小鼠,为线粒体疾病动物模型的制备提供了新方法。在阳性嵌和体母鼠(人/小鼠线粒体)与野生型公鼠交配后产下的仔鼠中未检测到人mtDNA,说明外源mtDNA未传递给后代。人mtDNA只在阳性母鼠的部分组织中有表达。