论文部分内容阅读
环维黄杨星D (Cyclovirobuxine D,简称CVB-D)是从黄杨科植物小叶黄杨(Buxus microphylla Sieb.et Zucc.Var.Sinica Rehd.et Wils)及其同属植物中提取得到的活性单体—生物碱,属孕甾烷衍生物,是黄杨宁片的主要成分。在临床上广泛用于心律失常、心绞痛、心肌缺血等治疗。近年来,对CVB-D的基础研究主要集中在其药理作用及其机制方面,毒理学研究报道较少。本实验室前期研究发现长期应用CVB-D能引起大鼠肾毒性,具有一定的剂量和时间依赖性关系,且病变在停药后不能彻底恢复。尽管如此,关于CVB-D肾脏毒性的机制目前尚无报道。基于此,我们将对CVB-D|肾脏损伤机制进行较为系统的研究,为临床应用提供合理依据。本研究主要包括以下内容：1.大鼠连续腹腔注射CVB-D两周后,检测各组大鼠尿液和血清中相关指标；检测肾皮质中生物膜和氧化相关指标；并做病理检查；此外基因芯片技术检测大鼠连续腹腔注射CVB-D 20 mg/kg 14天后与对照组大鼠肾脏基因表达的差异。结果显示,CVB-D各剂量组大鼠尿液中葡萄糖(Glu)和尿蛋白(TP)含量升高,血清中尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、Cl-含量升高并且降低大鼠肾皮质中Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性,但是对脂质过氧化方面的指标没有显著影响。病理检测结果显示CVB-D可致肾小球毛细血管球细胞增生,肾小管上皮细胞有变性、坏死,肾间质有少量炎细胞浸润等现象；基因芯片检测结果显示,CVB-D对大鼠肾脏中凋亡、细胞周期、死亡受体等方面的相关通路和基因有所影响。以上结果显示CVB-D在较短时间内腹腔注射给药也会引起肾脏毒性,毒性机制与其引起肾小球、’肾小管损伤和抑制生物膜活性相关。2.我们以HK-2细胞株为研究对象,在体外观察了CVB-D对肾小管上皮细胞的直接毒性。用比色法检测不同浓度CVB-D作用不同时间后HK-2细胞的活力变化、CVB-D对细胞LDH释放量的影响；倒置显微镜下观察CVB-D对细胞整体形态的影响；以及CVB-D对细胞周期和细胞内活性氧(ROS)水平的影响。结果发现,CVB-D可显著抑制HK-2细胞的增殖,促进细胞LDH的释放,且呈现时间和剂量依赖性,同时观察到细胞形态的变化如变圆、收缩,脱壁等变化。说明在实验设定的剂量和时间范围内,CVB-D对HK-2细胞具有明显的毒性作用。经CVB-D处理48h后,HK-2细胞出现S期阻滞,同时亚二倍体峰随着剂量的增加而增加；此外,CVB-D并未刺激HK-2细胞产生ROS。以上结果提示CVB-D对HK-2细胞的毒性可能与凋亡有关。3.CVB-D处理HK-2细胞后,用透射电镜观察细胞形态学改变,并用Hoechst染色法观察细胞核形态变化；用Annexin V/PI双染法在流式细胞仪上检测CVB-D对HK-2细胞的凋亡诱导；用分光光度法检测CVB-D对HK-2细胞caspase-3活化程度的影响；基因芯片技术检测60μg/ml CVB-D作用HK-2细胞48h对其相关通路及基因表达变化的影响。结果显示,HK-2细胞出现了明显的染色质凝聚、边集等凋亡早期现象,细胞核染色同时显示出凋亡特征；AnnexinV/PI染色确证CVB-D处理后HK-2细胞出现早期凋亡,并且几乎没有晚期凋亡/坏死现象；CVB-D可活化HK-2细胞caspase-3;基因芯片结果显示,CVB-D可通过Caspase cascade, Fas和P53等凋亡通路影响HK-2细胞的凋亡,并且上调DIABLO, FADD和Gadd45a等促凋亡基因。上述现象说明,CVB-D对HK-2细胞的毒性作用主要是通过细胞凋亡的诱导而产生的,并且和caspase-3有关。此外,CVB-D可通过Caspase cascade, Fas和P53等凋亡通路影响HK-2细胞的凋亡。4.观察CVB-D对Na+-K+-ATPase活性的影响,并用Western Blot方法检测CVB-D对Na+-K+-ATPaseα1和β1亚基蛋白表达的影响；此外,测定不同浓度CVB-D作用48h后对HK-2细胞线粒体膜电位和胞内Ca2+浓度的影响。结果显示,CVB-D对HK-2细胞Na+-K+-ATPase活性有显著抑制,具有浓度和时间的依赖性,并且显著下调了Na+-K+-ATPaseα1和Na+-K+-ATPaseβ1蛋白表达；CVB-D降低了HK-2细胞线粒体膜电位并且显著升高了胞内Ca2+浓度。以上实验结果显示,CVB-D通过下调HK-2细胞中Na+-K+-ATPaseα1和β1蛋白的表达从而抑制Na+-K+-ATPase的活性,导致细胞内Ca2+浓度升高,介导HK-2细胞凋亡