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目的:探讨Rac1蛋白对肝癌SK-Hep1和p~0SK-Hep1细胞凋亡及坏死性凋亡的影响及其机制,明确Rac1调控肝癌细胞凋亡及坏死性凋亡的方式,从而为肝癌的基因靶向治疗研究提供新的实验依据。方法:1、体外培养SK-Hep1细胞,并诱导其线粒体DNA缺陷细胞(p~0SK-Hep1),应用台盘蓝排除法鉴定活细胞,采用RT-PCR法检测COX-I及COX-II的表达。2、选取坏死性凋亡抑制剂Nec-1的三种不同浓度(30μM、60μM、90μM)和广谱凋亡抑制剂 z-VAD-FMK(10μM、20μM、40μM)作用于 SK-Hep1 细胞 24 h,MTS法检测药物的最适作用浓度,采用流式细胞术检测凋亡及坏死性凋亡比例。3、加入RaclsiRNA下调Rac1在SK-Hep1和p~0SK-Hep1细胞中的表达,采用流式细胞术检测凋亡率和坏死性凋亡率。4、用已筛选出的最佳作用浓度的Nec-1和z-VAD-FMK预处理SK-Hep1细胞和p~0SK-Hep1细胞24 h,分别转染FADD,RIP1和TRAF6三种siRNA沉默基因表达,RT-PCR和Western blot法检测三种基因是否沉默及Racl蛋白的表达。结果:1、台盘蓝排除法鉴定p~0SK-Hep1细胞在含100μg·L-1EB、未添加丙酮酸与尿嘧啶的培养基中,第6天几乎观察不到活细胞;在包含100 ug ·L-1 EB、丙酮酸和尿嘧啶的培养基中,p~0SK-Hep1细胞贴壁存活,极少数细胞悬浮。2、在 SK-Hep1 细胞中 COX-I、COX-II和内参(GAPDH)均表达,而在 p~0SK-Hep1细胞中COX-I、COX-II几乎不表达(P<0.01)。3、用不同浓度Nec-1和z-VAD-FMK干预SK-Hep1 24 h后在490nm条件下检测OD值,计算细胞存活率,在Nec-1浓度为30μM时细胞存活率有统计学意义(P<0.05),Nec-1浓度为60μM时存活率为104.72%,大于浓度为9OμM时的92.45%(P<0.05);z-VAD-FMK浓度为1OμM与对照组相比存活率有统计学意义(P<0.05),z-VAD-FMK浓度为2OμM时细胞存活率为91.10%,大于浓度为40μM时的87.82%(P<0.05)。4、检测未进行处理的SK-Hep1细胞凋亡及坏死性凋亡率分别为19.69%及12.36%;加入Nec-1干预细胞后凋亡率为21.90%;加入Z-VAD-FMK干预细胞后坏死性凋亡率为25.18%;同时加入Nec-1和Z-VAD-FMK共同干预设为对照组,凋亡及坏死性凋亡率分别为15.38%及17.52%;细胞凋亡率和坏死性凋亡率均有统计学意义(P<0.05)。5、RT-PCR检测结果显示,RaclsiRNA转染至SK-Hep1细胞后Racl mRNA表达明显降低(P<O.01)。流式术检测结果显示,未处理的SK-Hep1细胞组和p~0SK-Hep1细胞组的凋亡率分别为9.37%和13.04%,转染空白siRNA组细胞凋亡率分别为10.01%和10.18%,转染Rac1siRNA后的SK-Hep1细胞组细胞凋亡率为3.59%,转染RaclsiRNA后的p~0SK-Hep1细胞组的凋亡率为6.40%。与空白siRNA转染组相比,有显著性差异(P<0.01)。6、预先用 Nec-1 和 z-VAD-FMK 对 SK-Hep1 和 p~0SK-Hep1 处理后,转染 siRNA-FADD、siRNA-RIP1和siRNA-TRAF6 48 h时FADD、RIP1和TRAF6蛋白表达均明显减弱(P<0.01);在此基础上,SK-Hep1细胞在沉默TRAF6时Rac1的表达减弱(P<O.05),而在沉默FADD和RIP1后Rac1表达无明显变化(P>0.05);在p~0SK-Hep1细胞中,Rac1同样在沉默TRAF6后表达明显下降(P<0.01),而在沉默FADD和RIP1后,Rac1表达无明显变化(P>0.05)。7、转染 FADD、RIP1 和 TRAF6 后加入 Nec-1 和 z-VAD-FMK 发现,SK-Hep1 细胞在沉默TRAF6后Rac1 mRNA表达明显降低(P<0.01);对于p~0SK-Hep1细胞,Rac1 mRNA同样是在TRAF6被沉默后表达降低(P<0.05);而在沉默FADD和RIP1后,细胞中的Rac1 mRNA均无显著变化(P>0.05)。在PCR结果中,SK-Hep1和p~0SK-Hep1细胞中的Rac1 mRNA的表达均无明显差异(P>0.05)。结论:1、线粒体DNA缺失细胞(p~0SK-Hep1)模型构建成功。2、当坏死性凋亡受到阻断时诱导发生细胞凋亡;而在凋亡受阻时也激活坏死性凋亡通路。3、Rac1调控SK-Hep1细胞的凋亡过程,其机制可能通过TRAF6因子介导肝癌细胞发生凋亡及坏死性凋亡,而FADD和RIP1因子并无显著作用。4、线粒体DNA的缺失对Rac1在肝癌细胞中的表达无明显影响。