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鼻气管鸟杆菌病(Ornithobacterium rhinotracheale, ORT)是由鼻气管鸟杆菌引起的主要感染肉鸡和火鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病,临床上以呼吸道症状、生长障碍、死亡率增加为特征,病理上以严重的单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎、气囊炎为特征。目前,该病在欧洲、美洲、南非的许多发达国家流行,并呈上升的趋势,严重危害养禽业的发展。我国已有分离到该病菌的报道,因此,应引起人们的广泛注意。本课题对鼻气管鸟杆菌病的诊断方法做了详细的研究,成功建立了PCR、地高辛标记探针、间接ELISA检测方法,为ORT的诊断和流行病学调查奠定了基础,对预防和控制本病也具有重要意义。本研究内容分为三部分:一、气管鸟杆菌PCR诊断方法的建立与应用根据GenBank已发表的鼻气管鸟杆菌16S rRNA基因序列,设计1对可扩增671bp目的片段的引物,建立了检测ORT的PCR方法。该方法能在ORT参考菌株中扩增到特异性片段,而鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性;敏感性试验表明该方法最低检出限量为90pg DNA。表明所建立的PCR方法具有敏感性高、特异性强的特点。利用建立的方法对分离菌株进行检测,结果2株为阳性。二、地高辛标记探针检测鼻气管鸟杆菌的建立与应用利用PCR扩增鼻气管鸟杆菌16S rRNA基因的671bp的特异性片段,经回收纯化后用地高辛标记,建立了地高辛标记探针诊断ORT的方法。特异性试验表明,地高辛探针可与ORT不同血清型参考菌株的核酸发生特异性杂交,而与鸡大肠杆菌、副鸡嗜血杆菌、鸡白痢沙门氏菌、禽多杀性巴氏杆菌的核酸杂交均为阴性;敏感性实验结果表明,地高辛标记探针对ORT的最低检出量为100pg/μL;利用该探针对分离菌株进行检测,结果2株为阳性,利用该探针对211份疑似病料进行检测,结果4株为阳性,与PCR检测结果一致。三、鼻气管鸟杆菌间接ELISA检测方法的建立及应用提取A型鼻气管鸟杆菌(ORT)外膜蛋白,经纯化后包被反应板,通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、兔抗鸡酶标二抗稀释倍数,建立了检测ORT抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定确定最佳抗原包被浓度为11.85μg/mL,血清样品稀释倍数为1∶20,兔抗鸡IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1∶1000,抗原抗体最佳结合时间为1h,血清与二抗最适反应时间为45min。试验结果确定的判定标准为:样品OD490nm≥0.639判定为阳性,OD490nm≤0.350判定为阴性,介于二者之间的为可疑。试验证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,将205份疑似ORT的鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为11.7% (24/205)。