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前言:喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一。与其他肿瘤一样,喉癌也是环境因素和遗传因素共同作用的结果。尽管放化疗及外科手术等治疗方式已大大提升喉癌患者的预后及生存期,但侵袭和转移仍是喉癌患者死亡的主要原因。因此,致力于喉癌分子机制的研究有助于发现喉癌发生发展的相关分子靶标。MYCT1(Myc target 1)是由我们课题组在喉癌中首次鉴定并克隆得到的基因,曾命名为源于喉癌细胞的c-Myc靶基因(c-Myc target from laryngeal cancer cell,MTLC)。部分研究显示,MYCT1在不同肿瘤中发挥癌基因或抑癌基因的作用,提示其可能通过不同信号转导通路参与肿瘤发生发展,表现为明显的组织特异性。我们课题组前期研究发现,MYCT1能够抑制喉癌Hep-2细胞增殖、迁移并促进凋亡,提示MYCT1在喉癌中可能发挥抑癌基因的功能,但具体机制仍不清楚。microRNA(miRNA)参与包括肿瘤迁移在内的多种生物学进程,并在不同肿瘤中发挥不同作用。值得注意的是,mi RNA在肿瘤的诊断和治疗中已显示出潜在作用。我们课题组成功构建稳转MYCT1的Hep-2细胞系,并通过RNA-seq发现miR-629-3p表达显著降低。已有研究表明,miR-629-3p作为癌基因参与多种肿瘤的发生发展,但喉癌中miR-629-3p的作用未见报道。通过同位素标记相对和绝对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ),我们发现上皮剪接调节蛋白2(epithelial splicing regulatory protein 2,ESRP2)是MYCT1下游差异表达基因。生物信息学软件预测显示,miR-629-3p可能与ESRP2的3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)结合。ESRP2在乳腺癌、头颈部鳞癌以及肾透明细胞癌等多种肿瘤中发挥抑癌基因的功能,并且能够通过影响基因的选择性剪接而调控细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、粘附以及迁移等功能。通过生物信息学软件预测,我们还发现miR-629-3p启动子区存在SP1潜在结合位点。作为经典的转录因子,SP1倾向于结合靶基因启动子区富含GC的结构域,并且参与包括细胞运动在内的多种细胞进程。SP1在肺癌、结直肠癌等一些肿瘤中与预后不良显著相关,但在喉癌中研究报道罕见。我们课题组前期的研究发现,在喉癌中miR-23a-27a-24-2基因簇启动子区SP1甲基化结合位点去甲基化可促进喉癌细胞增殖并抑制凋亡。另有研究发现SP1可能是通过基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)相关信号通路参与喉癌侵袭。因此,我们推测可能存在MYCT1/SP1/miR-629-3p/ESRP2信号轴,MYCT1通过此信号通路参与喉癌的迁移侵袭。为证实该假设,本课题将首先研究MYCT1对SP1、miR-629-3p、ESRP2的调控关系,建立相关信号轴。在此基础上,进一步探索MYCT1是否通过该信号轴调控喉癌细胞EMT及迁移能力。本研究将丰富MYCT1在喉癌发生发展中的作用机制,为MYCT1相关信号通路在喉癌分子诊治靶标的进一步研究提供重要线索和依据。材料与方法:1、实验材料:人喉癌Hep-2细胞系、人胚肾HEK293细胞系、喉癌及癌旁组织标本。2、实验方法:细胞培养、基因瞬时转染、实时定量荧光PCR、Western Blot、染色质免疫沉淀技术、双荧光素酶报告基因活性检测、Transwell实验及划痕实验。结果:1、实时定量荧光PCR和Western Blot结果显示,在喉癌Hep-2细胞中转染MYCT1过表达载体后,miR-629-3p表达水平较对照组显著降低(P<0.05),ESRP2mRNA及蛋白表达水平较对照组均显著增高(P<0.05)。2、实时定量荧光PCR和Western Blot结果显示,喉癌Hep-2细胞中miR-629-3p表达水平较人胚肾HEK293细胞显著增高(P<0.05),喉癌Hep-2细胞中ESRP2mRNA和蛋白表达水平较人胚肾HEK293细胞均显著降低(P<0.05);喉癌组织中miR-629-3p表达水平较癌旁组织显著增高(P<0.05),喉癌组织中ESRP2 mRNA和蛋白水平较癌旁组织均显著降低(P<0.05)。3、临床资料分析结果显示,mi R-629-3p及ESRP2表达水平与患者年龄、性别及分化水平均无显著相关(P>0.05)。miR-629-3p表达水平与肿瘤分期及淋巴结转移呈显著正相关(P<0.05),而ESRP2表达水平与肿瘤分期及淋巴结转移呈显著负相关(P<0.05)。4、生物信息学软件预测结果显示,ESRP2 3’UTR区存在miR-629-3p潜在结合位点(397～403bp)。实时定量荧光PCR和Western Blot结果显示,转染miR-629-3p mimic后,喉癌Hep-2细胞中ESRP2 mRNA及蛋白表达水平较对照组均显著降低(P<0.05);转染miR-629-3p inhibitor后喉癌Hep-2细胞中ESRP2 mRNA及蛋白表达水平较对照组均显著增高(P<0.05)。5、双荧光素酶报告基因活性检测结果显示,与对照组相比,转染miR-629-3p mimic后,喉癌Hep-2细胞中野生型ESRP2 3’UTR的荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而转染miR-629-3p inhibitor后野生型ESRP2 3’UTR的荧光素酶活性显著增高(P<0.05),但miR-629-3p mimic和miR-629-3p inhibitor对突变型ESRP2 3’UTR的荧光素酶活性均无显著影响。6、生物信息学软件预测结果显示,mi R-629-3p启动子区存在SP1潜在结合位点(-466～-457bp)。染色质免疫沉淀技术结果显示,SP1能够与mi R-629-3p启动子区结合。7、实时定量荧光PCR结果显示,在转染SP1过表达载体的喉癌Hep-2细胞中,miR-629-3p表达水平较对照组显著升高(P<0.05);而敲减SP1则使mi R-629-3p表达水平较对照组显著降低(P<0.05)。8、双荧光素酶报告基因活性检测结果显示,在转染SP1过表达载体的喉癌Hep-2细胞中,3组miR-629-3p启动子区截短载体的荧光素酶活性较对照组显著增高(P<0.05),但组内无显著差异(P>0.05)。9、实时定量荧光PCR结果显示,在转染MYCT1过表达载体的喉癌Hep-2细胞中,SP1 mRNA及蛋白水平表达较对照组均显著下降(P<0.05)。10、Western Blot结果显示,在转染MYCT1过表达载体的喉癌Hep-2细胞中,上皮标志物E-Cadherin表达水平较对照组显著增高(P<0.05);间质标志物N-Cadherin、Vimentin与Twist-1表达水平较对照组显著降低(P<0.05),敲减ESRP2则能够显著抑制上皮标志物的表达并促进间质标志物的表达(P<0.05);且敲减ESRP2能够显著回复MYCT1对EMT标志物表达水平的影响(P<0.05);敲减ESRP2能够回复敲减miR-629-3p对EMT标志物表达水平的影响(P<0.05);过表达miR-629-3p能够回复敲减SP1对EMT标志物表达水平的影响(P<0.05);过表达SP1后能够回复MYCT1对EMT标志物表达水平的影响(P<0.05)。11、划痕实验及Transwell实验结果显示,转染MYCT1过表达载体的喉癌Hep-2细胞较对照组迁移能力显著降低(P<0.05);相反,敲减ESRP2的喉癌Hep-2细胞迁移能力显著增高(P<0.05),且敲减ESRP2能够显著回复MYCT1对喉癌Hep-2细胞迁移作用的影响(P<0.05);敲减ESRP2能够回复敲减miR-629-3p对喉癌Hep-2细胞迁移作用的影响(P<0.05);过表达miR-629-3p能够回复敲减SP1对喉癌Hep-2细胞迁移作用的影响(P<0.05);过表达SP1能够回复MYCT1对喉癌Hep-2细胞迁移作用的影响(P<0.05)。结论:1、MYCT1在喉癌细胞中抑制miR-629-3p的表达水平,促进ESRP2的表达水平。2、miR-629-3p在喉癌中高表达,与喉癌患者肿瘤分期及淋巴结转移显著正相关,提示miR-629-3p在喉癌中发挥癌基因作用。3、ESRP2在喉癌中低表达,与喉癌患者肿瘤分期及淋巴结转移显著负相关,提示ESRP2在喉癌中发挥抑癌基因作用。4、ESRP2是miR-629-3p靶基因之一。5、SP1可与miR-629-3p启动子区直接结合,并促进其转录活性。6、MYCT1在喉癌细胞中抑制SP1的表达。7、MYCT1可通过SP1/miR-629-3p/ESRP2抑制喉癌细胞EMT及迁移。