论文部分内容阅读
精原干细胞(Spermatogonial stem cells, SSCs)是雄性动物精子发生的基础,并通过自我增殖和分化产生大量的精子,维持雄性动物终生生育能力。动物睾丸中SSCs数量极少,建立一个有效的体外培养系统,使SSCs在体外大量增殖,以获得足量的SSCs,再对其进行转基因调控后,移植到供体动物体内或体外分化的方式获得通过减数分裂的精细胞或完整的精子,可为克隆动物、转基因动物生产及一些人类遗传性疾病的基因治疗提供新的途径。山羊是一种经济适用且孕期短家畜,能用于生产转基因重组蛋白和多种有价值的产品。因此,研究山羊SSCs体外增殖和分化调控的影响因素可逐步建立山羊SSCs体外培养系统,进而在生物医学的研究、农产品和生物制药业上更具有重要的意义。为了逐步建立一个有效的山羊SSCs体外培养系统,使SSCs在体外大量增殖,同时,为以后对山羊SSCs进行转基因调控后,制作转基因动物。本课题主要开展以下研究：(1)筛选合适日龄的山羊睾丸作为获取山羊SSCs的材料,以合适日龄的山羊为获得SSCs供体,筛选合适分离睾丸组织为细胞悬液的消化方法,再筛选的合适日龄和适当消化方法的基础上,进而筛选合适纯化富集山羊SSCs的纯化方法,建立山羊SSCs分离和纯化方法。(2)建立三种细胞系,以这三种细胞作为饲养层,研究饲养层对山羊SSCs促增殖作用及其机制。(3)在培养液中添加不同浓度的抗氧化剂Vc后,研究Vc山羊SSCs促增殖作用及其机制。(4)研究不同移植部位和肝细胞生长因子(HGF)对移植后睾丸细胞重构生精小管的能力及分化过程的影响。(5)探究在3D--SACS培养系统中,添加不同促分化因子对山羊SSCs的促分化作用及调控。以上研究获得结果如下：(1)随着山羊发育的性成熟,睾丸生殖细胞分化成多层细胞；不同日龄山羊睾丸经过三步酶消化后,所得睾丸细胞总数以5月龄最高,1月龄最低；流式细胞鉴定1月山羊Thy-1+细胞数显著高于3月龄、5月龄和大于2年的山羊(P<0.05)；培养10 d后,来源于1月山羊的Thy-1+细胞数最高(P<0.05),且克隆数和克隆区域最高。胰酶冷消化所得细胞数量显著(P<0.05)高于三步消化酶联合消化和两步酶消化,但细胞存活率显著低于三步酶和两步酶联合消化(P<0.05)；纯化后的细胞培养7 d后,以三步酶消化克隆数显著高于(P<0.05)两步酶和胰酶冷消化,而两步酶克隆数显著(P<0.05)高于胰酶冷消化。经过五种方法进行纯化后,抗体盘化法纯化后所得的细胞总数和Thy-1+细胞均最少,显著低于其他4组(P<0.05)；BSA+层粘连蛋白联合纯化所得到的Thy-1+细胞数最多,培养10 d后克隆数最多；五种方法纯化后克隆面积没有显著性变化(P>0.05),克隆均表现为AKP阳性。(2)在不同饲养层上,培养后4、7、12 d山羊SSCs克隆形态不会发生变化,表现为AKP染色阳性,均表达SSCs标记物p1-整合素、a6-整合素、Oct-4、PLZF和Vasa；克隆数以GEF饲养层上最多,克隆面积以GSC饲养层上最大,MEF饲养层上克隆数和面积均最小；无论培养时间长短,SSCs促生长关键因子GDNF、bFGF和IGF1含量在GSC饲养层中含量最高,而LIF含量最低；而另两种成纤维细胞饲养层几种因子分泌量差别不大。(3)培养10 d后,山羊SSCs在不同浓度的Vc培养液中能够形成致密的克隆,不同浓度的Vc不影响山羊SSCs克隆形态,而SSCs克隆数和区域均以添加40μg/mLVc最大；且流式细胞检测在添加40 μg/mL Vc组Thy-1+和Oct-4+细胞数最多；不同Vc组均表达SSCs标记物和AKP活性。此外,在不同Vc组均随着培养时间延长而ROS增多；但在同一培养时间内,40 μg/mL Vc组的ROS含量均最低,且抗凋亡基因Bcl-2的表达增强,而抑制凋亡基因Bax和P53的表达减弱。(4)三步酶消化后细胞悬液制成移植块移植后20 d,移植到肾包膜下HGF处理和未处理与移植到背部皮下HGF处理和未处理四组之间移植块重量差异均不显著(P>0.05)；在移植后40、60 d,移植到肾包膜下HGF处理后移植块重量显著高于背部皮下和肾包膜下HGF未处理组(P<0.05),其余各组差异不显著(P>0.05); RT-PCR和qRT-PCR检测表明,减数分裂前基因PGP9.5、Thy1、Oct4和生殖细胞标记物VASA表达量未见明显变化,但减数分裂细胞标记物STRA8、SCP3及减数分裂后细胞标记物Prm-1、Acrosin 以 HGF处理后移植到肾包膜下表达最强。(5)三步酶消化后细胞悬液中含有支持细胞、生殖细胞、管周肌样细胞和间质细胞。在3D-SACS培养系统中诱导分化培养30、50和70 d后,经过倍体分析发现均以试验三组的分化效果最好；且培养克隆中单倍体生殖细胞标记物HSC70t的表达量均以试验三组最高；通过RT-PCR和qRT-PCR检测可知,在分化培养后的30、50和70 d,减数分裂前基因Thy-1和Oct4在各组中表达量均没有显著性差异(P>0.05)。PGP9.5在培养后30 d,对照组PGP9.5表达量显著高于试验三组(P<0.05),其他各组之间差异不显著(P>0.05)；在培养后50和70 d,各组之间差异均不显著(P>0.05)。在分化培养后的30 d,对照组c-Kit表达量显著低于试验二组和三组(P<0.05)；在分化培养后的50、70 d,c-Kit表达仍以试验三组表达最强,显著高于对照组(P<0.05),但其他各组之间差异不显著(P>0.05)。减数分裂期基因Scp3、Stra8在分化培养后30、50和70 d,对照组Scp3表达量显著低于其他三组(P<0.05)：减数分离后基因Acrosin和Prm-1在分化培养后30、50和70 d,在对照组减数分离后基因的表达显著低于其他三组(P<0.05)。通过以上研究得到结论如下：(1)以1月山羊适合为分离SSCs的供体动物,通过三步酶消化最充分,所得SSCs数量最多,再以BSA+层粘连蛋白联合纯化后,得到的SSCs数量最多,活性最强。(2)山羊GSC和GEF更适合用于山羊SSCs的培养。(3)在山羊SSCs培养液中添加40μg/mL Vc能达到最好的促增殖效果。(4)移植到肾包膜后精子发生过程要优于移植到背部皮下；且HGF能够促进移植后不同位置(背部皮下和肾包膜下)移植块中细胞的迁移、血管的形成和免疫保护作用。(5)在培养液中添加10 ng/mL SCF+10-5 mol/L RA+50 IU/L FSH+1μmol/L T后,3D-SACS培养系统中生殖细胞分化效率最高。