骨骼肌在动物体生命活动中承担重要责任。骨骼肌的生长发育始终复杂且有序的进行着,在骨骼肌生长过程中最先形成肌源性干细胞,然后增殖成为成肌细胞,最后再分化并融合形成多核肌管,最终一步步形成肌肉组织。在这一过程中每一时期的肌细胞始终受到环境中多种肌肉分化基因及相关信号通路的调控,其中经典Wnt/β-catenin信号通路在肌肉生长发育与再生中扮演着重要角色。WISP1是由经典Wnt/β-catenin信号通路的配体Wnt1诱导产生的下游蛋白。WISP1也被称为CCN4,其同时属于在分化过程中起重要作用的CCN家族成员。有文献报道WISP1在迁移,粘附,增殖,成骨及癌症等领域具有重要作用。而我们的前期实验则发现WISP1在牛肌肉卫星细胞中表达升高,那么我们推测WISP1在分化过程中也可能起重要作用,但其促进分化的具体作用机制尚不清楚,也未见报道。在本研究中,首先在体外分化的牛肌肉卫星细胞中检测了WISP1的表达规律。利用软件预测出WISP1启动子上与分化功能相关的转录因子结合序列,构建了WISP1基因的激活和抑制载体,同时使用si RNA片段干扰WISP1基因表达,检测了WISP1对体外分化的牛肌肉卫星细胞的影响。接下来为了研究WISP1影响牛肌肉卫星细胞体外分化的机理,利用免疫共沉淀和ESI质谱法分析出与其相互结合的蛋白ANXA1并利用CO-IP技术验证了结果。接下来用同样的方法检测了ANXA1在体外分化的牛肌肉卫星细胞中的表达规律及作用。为了确定WISP1是否调节ANXA1,我们分别激活和抑制或干扰了WISP1的表达并检测ANXA1的表达及ANXA1调节的TGF-β信号通路相关标志分子的表达。最后利用激活WISP1同时抑制ANXA1的方法检测到体外分化的牛肌肉卫星细胞中的ANXA1减少后,WISP1促进TGF-β信号通路表达从而促进分化的作用被抑制。主要研究结果如下:(1)利用免疫荧光及蛋白免疫印迹技术检测体外分化的牛肌肉卫星细胞中WISP1的表达规律。结果表明,随着牛肌肉卫星细胞体外分化进程加深,WISP1的荧光强度逐渐增加,WISP1的表达量在第5天达到最高并维持在相应水平。(2)通过构建WISP1基因的激活和抑制载体或设计合成干扰si RNA的干扰片段分别上调和下调体外分化的牛肌肉卫星细胞中WISP1的蛋白表达量并观测该基因对牛肌肉卫星细胞体外分化的影响。结果显示,激活WISP1的表达,能显著上调WISP1的蛋白表达量,同时体外分化的牛肌肉卫星细胞的肌管融合程度明显增加,肌肉分化标志分子Myo G的表达明显增加。抑制或干扰WISP1的表达,结果与WISP1激活的结果相反。说明WISP1能够促进牛肌肉卫星细胞体外分化。(3)利用免疫共沉淀和ESI质谱法检测在牛肌肉卫星细胞体外分化过程中与WISP1相互结合的蛋白,通过相关文献报道及资料分析选出与之相互结合的蛋白ANXA1,并使用CO-IP的方法进行验证。结果显示,WISP1与ANXA1相互结合。(4)利用免疫荧光及蛋白免疫印迹技术检测体外分化的牛肌肉卫星细胞中ANXA1的表达规律。结果表明,随着牛肌肉卫星细胞体外分化进程加深,ANXA1的荧光强度逐渐增加,WISP1的表达量在第5天达到最高随后逐渐下降。(5)利用CRISPR/d Cas9技术构建的激活和抑制载体能够明显的增加或减少ANXA1蛋白的表达,si RNA干扰片段能明显减少ANXA1的蛋白表达量,并且肌管融合程度与肌肉分化标志分子Myo G的表达量也随之增加或减少。说明了ANXA1基因能够促进牛肌肉卫星细胞的体外分化。(6)利用上述激活和抑制或干扰WISP1的方法探究WISP1促进牛肌肉卫星细胞体外分化的分子机制。结果显示,激活WISP1的表达,能显著上调体外分化的牛肌肉卫星细胞中内源性WISP1蛋白的表达量,同时ANXA1及TGF-β信号通路相关标志分子的表达量显著增加,抑制或干扰WISP1的表达,结果与激活WISP1的结果相反。(7)利用上述WISP1激活载体及ANXA1的si RNA干扰片段,激活WISP1的同时干扰ANXA1的表达,检测体外分化的牛肌肉卫星细胞中TGF-β信号通路相关标志分子及肌肉分化的标志分子Myo G的表达。结果显示,与单独激活WISP1组相比,激活WISP1同时抑制ANXA1的表达,相关蛋白表达水平显著下降。说明WISP1通过调节ANXA1进而调控TGF-β信号通路表达从而促进牛肌肉卫星细胞的体外分化。这项研究揭示了经典的Wnt/β-catenin信号通路促进分化的一条可能的途径,明确了WISP1在牛肌肉卫星细胞体外分化过程中的促进作用及其分子机制,并表明经典Wnt/β-catenin与TGF-β信号通路之间可能存在的联系。在实际生产中,可为提高牛肉产量、改良家畜品种提供理论依据,也为肌肉生长发育、肌肉修复和再生提供新思路。