基因治疗可望广泛应用于单基因遗传病以及肿瘤等疾病的治疗，成为近几年来生命科学和生物医学技术领域的研究热点，其中腺病毒作为基因治疗极为重要的载体之一，其规模化高效制备技术则是基因治疗的主要技术关键。　　 通常情况下腺病毒的感染和复制与细胞的生理状态之间具有直接的关系，当腺病毒在细胞生长达到较高密度进行感染扩增时，往往存在着病毒感染率低、单位细胞病毒扩增效率下降、病毒产量低等问题，从而显著影响腺病毒载体规模化制备的效率和经济性，制约其在基因治疗中的广泛应用。究其原因主要在于目前人们对腺病毒感染复制过程的认识还非常有限，例如(1)病毒对细胞的感染及其复制过程到底受哪些环境因素的影响以及如何影响，目前还缺乏必要的工程研究；(2)对细胞本身的生理状态影响腺病毒感染和复制的作用及其程度还没有足够的认识；(3)对细胞在感染和复制病毒过程中的营养物代谢尚缺少必要的研究和认识，未能针对病毒感染和复制这一特殊过程开发专门的培养基，以致在营养方面无法满足病毒扩增过程的特殊需求。为此，本文针对HEK293细胞培养过程中病毒感染复制这一特殊过程，首先考察细胞在被病毒感染后的生长代谢特性，以及感染条件对病毒感染率和单位细胞病毒扩增效率的影响，并在此基础上进一步研究细胞生理状态和钙离子浓度对病毒感染、复制的影响，以探究细胞在高密度条件下影响病毒感染率和扩增效率的因素及其作用机制，为未来规模化高效制备腺病毒载体过程的开发提供科学指导和优化策略。　　 本文首先考察了HEK293细胞有血清贴壁及无血清悬浮培养二种条件下MOI、TOI以及病毒感染时的细胞密度(CCI)对细胞生长代谢特性、病毒感染率及单位细胞病毒扩增效率的影响。结果表明细胞在被病毒感染后的生长受到明显抑制，但其代谢较正常生长细胞旺盛。MOI能显著影响细胞的生长代谢，MOI值越高对细胞生长的抑制作用越强，但同时也提高了病毒感染率和单位细胞的病毒扩增效率。不论是贴壁培养还是无血清悬浮培养，MOI值为5时可获得较为理想的病毒感染率和单位细胞病毒扩增效率。TOI对病毒感染后的细胞生长代谢没有显著影响，但能显著影响病毒感染率和单位细胞的病毒扩增效率，其中TOI取48h时为最优值。提高CCI后由于存在营养物限制及副产物累积问题，导致单位细胞的病毒扩增效率大幅度下降，通过换液操作可在一定程度上改善病毒扩增效率。　　 据此本文在无血清悬浮培养条件下进一步分析了批培养和换液培养过程中细胞本身的生理状态变化，并以细胞表面CAR蛋白表达水平和S期细胞比例作为表征参数，探讨了细胞生理状态对病毒感染和复制的影响。研究结果表明，在批培养过程中随着培养环境的改变，细胞生理状态也随之发生变化，细胞接种后CAR蛋白表达水平和S期细胞比例随着培养过程的进行逐渐提高，在36～48h之间两者均达到最高值，此后逐渐下降。通过换液操作以改善培养过程后期的培养环境和细胞生理状态，使细胞表面CAR蛋白表达和S期细胞比例维持在较高的水平，可使病毒感染率及单位细胞病毒扩增效率均得到有效提高。另外，实验结果证明TSA能有效促进细胞表面CAR蛋白的表达，从而显著提高单位细胞的病毒扩增效率，说明CAR蛋白在病毒感染和复制过程中发挥了重要作用。　　 针对细胞在高密度条件下病毒复制能力下降、病毒产量低等难题，本文在无血清悬浮培养条件下考察了钙离子浓度及其添加时间对病毒感染率及单位细胞病毒扩增效率的影响，并探讨了钙离子在病毒感染和复制过程中所起的作用。结果表明提高钙离子浓度，能显著提高单位细胞的病毒扩增效率，特别在细胞高密度条件下其作用尤为明显。然而在病毒感染率方面由于过高的钙离子浓度(大于0.5 mmol/L)往往会引起细胞结团现象的发生，因此提高钙离子浓度对病毒感染率具有负面影响，甚至导致单位细胞病毒扩增效率的下降。因此，为了保证较为理想的病毒感染率，并且充分发挥钙离子对病毒复制的促进作用，可采用在病毒感染阶段维持较低的钙离子浓度，而在病毒复制阶段再相应提高钙离子浓度的策略，实验结果显示提高钙离子浓度的最佳时间点在病毒感染后的6～12 h。另外，研究发现细胞复制病毒所需的临界钙离子浓度与病毒感染时的细胞密度之间存在线性关系，细胞密度越高，所需的临界钙离子浓度也需相应提高。　　 最后，通过比较自制DF6和进口EX-Cell无血清培养基在支持细胞生长、病毒感染和复制方面的差异，结果表明虽然自制DF6无血清培养基在支持细胞高密度生长方面的表现还相对较弱，但得益于本文对腺病毒感染和复制过程的研究结果，根据细胞生长、病毒感染和复制各阶段的特点及营养需求，经过调整和优化后自制DF6无血清培养基在病毒扩增效率方面显著优于进口EX-Cell培养基。　　 本文研究结果表明，细胞生理状态在腺病毒感染和复制过程中发挥了重要作用。同时，在细胞高密度条件下，合理调整培养基的成分，能显著提高病毒体积产量。另外，本文设计开发的DF6无血清培养基能有效支持细胞长期生长和病毒扩增，特别是其优良的病毒扩增效率，将为今后建立高效稳定的腺病毒规模化制备过程发挥重要作用。