柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)是一种寄生于鸡盲肠的单细胞寄生原虫，是鸡球虫病的主要病原体，目前国内外对鸡球虫病的防治主要依靠药物。长期使用药物使其对药物表现出严重的抗性，给禽类的养殖带来了大量的经济损失。为研究鸡球虫耐药性产生的机制，本实验室前期以柔嫩艾美耳球虫的药物敏感株(DS)为亲本，诱导出抗地克珠利耐药株(DZR)和抗马杜拉霉素耐药株(MRR)。对2个耐药株和敏感株进行转录组测序，筛选了敏感株与耐药株的差异表达基因。在此基础上，本研究选择4个在耐药株体内显著上调的基因，分别为柔嫩艾美耳球虫含HD域蛋白(HD domain-containing protein，EtHDCP)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydiogenase，EtGAPDH)、伴侣蛋白TCP-1环状复合物亚基α(T-complex protein1subunitα，EtTCP-1α)和苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase，EtMDH）。对这4个基因进行特性和功能的初步分析，并用全基因组重测序的方法对敏感株和2个耐药株进行测序，以期蛋白水平和基因水平寻找球虫耐药性产生的可能机制。　　1.EtHDCP、EtGAPDH、EtTCP-1α和EtMDH基因的克隆和生物信息学分析　　以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA第一链为模板，PCR扩增获得了EtHDCP、EtGAPDH、EtTCP-1α和EtMDH的ORF序列。EtHDCP的ORF序列长462bp，编码153个氨基酸，该基因编码的蛋白分子量为16.8kDa，没有跨膜结构和信号肽，功能域结构分析表明EtHDCP具有N-糖基化位点等多种结构域。EtGAPDH的ORF序列长1.020bp，编码339个氨基酸，该基因编码的蛋白分子量为37.3kDa，没有跨膜结构和信号肽，功能域结构分析表明EtGAPDH含有3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性位点等多种结构域。EtTCP-1α的ORF序列长843bp，编码280个氨基酸。该基因编码的蛋白分子量为30.8kDa，役有跨膜结构和信号肽，功能域结构分析表明EtTCP-1α含有分子伴侣分子TCP-1标签2位点等多种结构域，属于TCP-1/cpn60分子伴侣家族。EtMDH的ORF序列长954bp，编码317个氨基酸。该基因编码的蛋白分子量为339kDa，没有跨膜区和信号肽，功能域结构分析表明EtMDH含有乳酸/苹果酸脱氢酶活性位点等多种结构域。利用定量PCR对柔嫩艾美耳球虫发育的4个不同阶段（未孢子化卵囊，Unsporated oocysts，UO，孢子化卵囊，Sporated oocysts，SO;子孢子，Sporozoites，SZ,第二代裂殖子，Second-generation merozoites，SM)中EtHDP、EtGAPDH、EtTCP-1α和EtMDH的mRNA转录水平进行检测，结果显示:EtHDCP基因在SM阶段高表达，在其他3个发育阶段的转录水平极低，EtGAPDH基因在4个发育阶段均有一定的转录，由高到底依次为SM、UO、SZ、SO，EtTCP-1α基因在UO、SO、SM阶段均有一定的转录，由高到底依次为SM、UO、SO，但在SZ阶段的转录水平极低，EtMDH基因在4个发育阶段均有一定的转录，由高到底依次为SM、UO、SO、SZ。　　2.EtHDCP、EtGAPDH、EtTCP-1α和EtMDH原核重组蛋白的表达和功能初步分析　　将EtHDCP、EtGAPDH、EtTCP-1α和EtMDH基因的ORF分别连接到原核表达载体pGEX-4T-2、pCOLDI、pET-28a和pGEX-4T-2中，构建了原核表达重组质粒pGEX-4T-EtHDCP、pCOLDI-EtGAPDH、pET-28a-EtTCP-1α和pGEX-4T-EtMDH。4个重组质粒经PCR和测序鉴定正确后，分别将其转入大肠杆菌BL21感受态细胞，经IPTG在不同条件下诱导，成功表达了重组蛋白GST-EtHDCP(rEtHDCP)、HIS-EtGAPDH(rEtGAPDH)、HIS-TCP-1α(rEtTCP-1α)和GST-EtMDH（rEtMDH）。经分析，重组蛋白rEtHDCP、rEtGAPDH和rEtTCP-1α都以包涵体形式表达，而rEtMDH则以可溶性形式表达。经切胶纯化(rEtHDCP、rEtGAPDH和rEtTCP-1α)和经GST柱（rEtMDH）纯化后分别获得了4个重组蛋白，用佐剂乳化纯化的rEtHDCP、rEtGAPDH、rEtTCP-1α和rEtMDH并分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠获得相应的多抗血清。经Western blot分析表明重组蛋白rEtHDCP、rEtGAPDH、rEtTCP-1α和rEtMDH都具有良好的反应原性，荧光定量PCR和Western blot分析表明EtHDCP、EtGAPDH、EtTCP-1α和EtMDH在2个耐药株的表达均上调，对EtGAPDH和EtMDH的酶活性分析表明2个耐药株的GAPDH和MDH活性均高于敏感株。利用间接免疫荧光定位对EtHDCP、EtGAPDH、EtTCP-1α和EtMDH在SZ和SM等虫体不同发育阶段的分布进行分析，结果显示:EtHDCP主要位于SZ和SM阶段的的虫体表面，SZ加入DF-1细胞48h后，蛋白表达增加，EtGAPDH主要位于SZ的表面和SM的细胞质，SZ加入DF-1细胞48h后，蛋白表达量增加;EtTCP-1α主要位于SZ和SM的表面，SZ加入DF-1细胞24h后，分布于除后端折光体外的整个虫体;EtMDH广泛分布于SZ阶段除折光体外的部分和SM的表面，SZ加入到DF-1细胞中2h后则主要分布于顶端，当SZ加入DF-1细胞48h后，蛋白表达增加。体外抑制实验表明，经anti-rEtHDCP和anti-rEtMDH抗体作用后的SZ入侵细胞能力明显下降，当抗体浓度升至400μg/mL时，anti-rEtHDCP抗体的抑制率超过40％,anti-rEtMDH的抗体抑制率为40％左右。　　3.基于全基因组重测序的敏感株与耐药株SNP位点筛选　　收集、纯化柔嫩艾美耳球虫DS、DZR、MRR的孢子化卵囊，提取虫体DNA，用全基因组重测序的方法对DS、DZR、MRR进行了分析，过滤原始数据得到有效数据，在40×覆盖深度下，使用PoPoolation2软件中的Fst与shding window方法，筛选到45个耐药相关基因，GO分析和KEGG分析表明，这些基因参与球虫的生物进程、细胞组成和分子功能。进一步对比分析发现耐药株体内存在乙酰辅酶A羧化酶基因(acetyl-CoA carboxylase，ACC)的50424C＞S、50438G＞K、50443G＞R、51264A＞R和51321C＞S突变，而敏感株体内不存在;耐药株体内存在钙/钙调素依赖性3，5-环核苷酸磷酸二酯酶(calcrum/calmodulin-dependent3，5-cyclic nucleotide phosphodresterase，CaM-PDE)619583G＞K、619603C＞S、619605A＞R和619607G＞S突变，而敏感株体内不存在;敏感株体内存在热重复家族蛋白（Heat repeat family protein，HRFP）2164C＞Y、2170T＞W和2173G＞R突变，而耐药株体内不存在。