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病原真菌具有危害范围广和繁殖速度快的特点,是农业生产中面临的最巨大的挑战之一。桑椹营养丰富、口感鲜美并富含多种活性物质,具有很高的食药用价值。而桑实杯盘菌引起的桑椹肥大性菌核病作为桑椹生产中的毁灭性病害,每年都会造成桑椹的大量减产。桑实杯盘菌是属于核盘菌科杯盘菌属的一种死体营养型真菌,不仅造成桑椹感病,还能侵染油菜、番茄和烟草。而真菌迅速的遗传变异速度导致其耐药性不断增加,因此急需寻找新的高效防治手段。G蛋白信号通路是真核生物中保守存在的一种信号通路,对于感知、响应、传递外界的各种刺激信号具有十分重要的作用。丝状真菌中G蛋白信号对于真菌的营养生长、发育、生殖、毒素产生和致病性具有重要的作用,而桑实杯盘菌中G蛋白信号相关研究还未见报道。研究桑实杯盘菌异三聚体G蛋白相关基因介导的致病机理将为发展新的防治手段提供理论基础。宿主诱导的基因沉默（Host-Induced Gene Silencing,HIGS）是通过在宿主中表达靶向真菌关键致病基因的干扰片段,进而沉默靶基因的表达来达到提高宿主抗病能力的目的。目前,HIGS既是一种运用反向遗传学研究真菌基因功能的重要手段,又是抗性育种的一种新策略。本研究通过在桑实杯盘菌中筛选异三聚体G蛋白相关基因并对其在桑实杯盘菌生长、发育以及致病中的作用进行分析;在此基础上,我们构建了HIGS沉默载体,并对转基因植株的抗病能力进行评估。获得的主要结果如下:1.从桑实杯盘菌基因组筛选到3个Gα基因（CsGPA1、CsGPA2和CsGPA3）,2个Gβ基因（Csgb1和Csgb2）和1个Gγ基因（Csgg1）。同源比对表明,桑实杯盘菌异三聚体G蛋白序列与核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和灰霉菌（Botrytis cinere）有着较高的相似性,同时其蛋白结构也相对比较保守。转录表达分析表明,CsGPA1、CsGPA2、CsGPA3和Csgg1在初生菌核及成熟菌核中有着较高的表达量,表明这些基因可能在菌核形成过程中发挥作用。在侵染过程中,CsGPA1、CsGPA3、Csgb2和Csgg1在侵染后12 h出现上调表达,表明这些基因可能在侵染初期至关重要。酵母双杂交实验表明CsGPA2、CsGPA3、Csgb1和Csgb2均与CsRGS3存在直接互作,而Csgg1与CsRGS4存在直接互作关系,表明桑实杯盘菌G蛋白信号调控具有一定的保守性。2.为了研究G蛋白α亚基功能,构建了真菌干扰载体并对桑实杯盘菌进行了转化。结果表明,沉默CsGPA1和CsGPA3不影响桑实杯盘菌菌丝生长,但降低菌核形成数量并增强真菌对氧化和渗透胁迫的耐受性;同时还降低了附着胞形成数量和致病性。而沉默CsGPA2仅导致菌核形成减少,对桑实杯盘菌菌丝生长、胁迫响应、附着胞形成以及致病能力没有显著影响。此外,RT-q PCR结果表明,沉默菌株中cAMP和MAPK信号相关基因表达量显著下调,表明G蛋白α亚基参与cAMP和MAPK信号的调控。3.利用RNAi沉默桑实杯盘菌G蛋白β亚基编码基因Csgb1和Csgb2导致菌丝生长变缓、菌核形成减少、对氧化和细胞壁胁迫耐受性增加,并显著减少了附着胞形成数量和致病力,其中沉默Csgb2对附着胞和致病性的影响更大,可能在桑实杯盘菌致病过程中发挥更为重要的作用。进一步对cAMP和MAPK信号相关基因表达分析,在沉默菌株中只有CsSAKA被不同程度上调,其余四个基因均被显著下调,表明Gβ可能通过调控cAMP和MAPK信号进而调控桑实杯盘菌附着胞形成和致病。4.对桑实杯盘菌G蛋白γ亚基进行功能分析,结果表明,沉默Csgg1呈现出与Csgb2干扰菌株相似的表型,表现为菌丝生长速率降低、菌核形成减少以及对氧化和细胞壁胁迫耐受性增加,同时cAMP和MAPK信号相关基因表达量显著下调、真菌附着胞数量和致病能力降低,表明Csgg1也参与桑实杯盘菌的致病。5.参考前面功能分析的结果,选取参与桑实杯盘菌致病的CsGPA1、CsGPA3、Csgb2和Csgg1为靶点,构建相应的HIGS沉默载体并获得相应的烟草和番茄转基因株系。对转基因烟草的抗病性测定发现,转基因植株抗病能力显著提高,利用WGA-AF488染色对叶片组织观察发现,叶片中侵染菌丝和附着胞数量也显著减少;进一步对沉默Csgb2和Csgg1的转基因番茄抗病性鉴定,结果表明,病斑面积显著减小,同时转基因番茄中检测到大量靶基因对应的SiRNA,以上表明通过HIGS沉默CsGPA1、CsGPA3、Csgb2和Csgg1能够显著提高烟草和番茄的抗病能力。综上所述,本课题通过对桑实杯盘菌异三聚体G蛋白相关基因功能研究,证实了异三聚体G蛋白在桑实杯盘菌菌丝生长、菌核和附着胞形成、以及致病中的作用。并初步揭示了HIGS技术可以应用于提高烟草和番茄对桑实杯盘菌抗性,为HIGS技术介导的抗病育种提供了重要的靶点和技术支撑。