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获得理想的细胞类型是再生医学长久的目标,对生物医学的发展及动物繁育方面有着巨大影响,如细胞治疗、药物研究、疾病模型制作、器官体内再生、动物育种、转基因动物生产以及乳腺生物反应器等方面。体细胞重编程以及转分化技术为上述研究提供了很好的细胞来源。这些技术主要通过转录外源因子方法获得目的细胞包括多能干细胞和不同谱系细胞,但诱导效率相对较低及引入病毒和外源基因极大限制了临床应用。而小分子化合物的使用不仅可以提高诱导效率,同时可以替代外源转录因子,这种方法有望解决上述问题。因此小分子化合物方法有望是获得理想细胞类型的有效途径。该方法在大家畜重编程和转分化研究较少,而完全使用小分子化合物诱导体细胞获得多能干细胞和其他细胞类型在大家畜上没有出现报道。为进一步了解小分子化合物在山羊体细胞重编程和转分化方面的影响,本研究首次使用完全化学诱导体系获得山羊CiPSCs样细胞克隆形成。另外对其化学诱导体系相关分子机理进行了初步探讨以及体系优化的研究,并初步探讨了小分子化合物诱导山羊成纤维细胞转分化的研究。通过上述研究以期获得安全有效的细胞类型,为山羊化学诱导体系及相关机理研究提供理论依据,同时也为细胞模型、动物育种、转基因动物生产等研究奠定基础。1.小分子化合物诱导山羊多能干细胞（CiPSCs）的初步研究利用创新的完全小分子化合物体系诱导山羊耳缘成纤维细胞,获得无病毒无外源基因整合的山羊诱导多能干细胞（giPSCs）。结果显示山羊CiPSCs样细胞克隆呈现圆形或者岛屿状三维立体结构,表达强的碱性磷酸酶活性。RT-PCR结果显示CiPSCs样细胞表达多能性相关基因,免疫荧光结果表明获得的CiPSCs样细胞表达OCT4、SOX2、E-CADHERIN以及表面特异性抗原SSEA-1。体外分化实验结果证实CiPSCs样细胞具有自发分化形成拟胚体及三胚层细胞的能力。胚胎嵌合潜力的检测结果显示显微注射GFP-CiPSCs样细胞的胚胎培养至囊胚阶段获得表达GFP的嵌合体囊胚。以上的实验结果证明我们已经首次初步建立了获得小分子化合物诱导山羊多能干细胞样细胞（CiPSC-like）的技术平台,同时验证了这些获得的细胞具有部分多能性,为下一步的研究奠定了基础。2.细胞能量代谢及表观遗传修饰的相关基因对山羊化学诱导多能干细胞样细胞（CiPSC-like）克隆形成的影响本研究探讨在化学诱导重编程过程中山羊CiPSCs样细胞的代谢以及表观遗传修饰的变化,从而初步探明山羊CiPSCs样细胞克隆形成的可能机理。根据诱导后是否出现CiPSCs样细胞克隆,在本实验中分为CiPSCs样细胞克隆组和无克隆组。实验结果表明CiPSCs样细胞克隆组具有强的碱性磷酸酶活性（AP）,糖酵解相关基因PGAM1,PKM2和HK2表达水平显著高于亲代成纤维细胞,乳酸水平显著高于亲代成纤维细胞。而无克隆组只出现少数单个细胞AP阳性,表观遗传修饰相关基因KDM5B表达水平极显著高于亲代成纤维细胞。综合上述结果表明糖酵解相关基因PGAM1,PKM2 HK2和表观遗传修饰相关基因KDM5B可能与山羊CiPSCs样细胞克隆的形成有密切关系。3.小分子化合物诱导山羊多能干细胞样细胞（CiPSC-like）重编程体系的优化本研究收集可能影响体细胞重编程形成克隆效率和质量的小分子化合物,从而建立小分子化合物筛选库。在原有诱导体系下,通过逐个减少小分子化合物的添加,从而为进一步优化体系奠定基础。研究结果表明在原有山羊化学诱导条件下（以下简称为“VCPTFND”）,添加一些小分子化合物或者组合可以将重编程效率,其中AMI-5和A83-01的添加可显著提高重编程效率。在“VCPTFND”条件下撤掉CHIR98014后,可诱导细胞形成类人iPSCs形态克隆;而添加WNT通路抑制剂WNT-C59或者IWP 2后,类克隆数目减少且直径变小,且AP阳性克隆率显著下降。以上结果表明在山羊化学诱导体系“VCPTFND”下,添加AMI-5和A-83-01可以显著提高山羊CiPSC样细胞重编程效率。诱导体系中抑制WNT信号通路可能会阻碍化学诱导重编程。4.小分子化合物诱导山羊成纤维细胞转分化的研究本研究探讨了山羊成纤维细胞在“VPTFN”化学诱导体系下获得的类克隆所处的状态。结果显示山羊成纤维细胞在“VPTFN”诱导体系下,出现类似人ES/iPSCs。结果显示类克隆细胞表达SOX2,E-CADHERIN以及不同胚层相关基因。另外细胞的组蛋白H3K4甲基化,H4K8及H3K9乙酰化水平显著高于对照组,线粒体特异性荧光染色荧光均值显著低于对照组,ROS含量显著低于对照组。利用了转录组学测序分析技术对上述获得的细胞进行分析,结果显示该诱导过程转录水平变化主要集中在与系统发育,胚层发育以及器官发育方面上。诱导8d的细胞成纤维细胞关键标志基因表达水平显著下降,不表达多能性相关基因等。而胚胎发育过程中调控基因表达的JARID2以及调节谱系定型在细胞命运等起关键作用的基因ID2显著上调;神经祖细胞标志基因SOX2、PAX6,造血干细胞标志基因THY1以及乳腺祖细胞标志基因LTF、CD44都出现显著上调,与神经,心肌,骨骼肌等发育相关基因 TFAP2C、SOX7、TNNT1、AREG及AKAP6显著上调。QRT-PCR结果显示“VPTFN”诱导条件下获得的类克隆的成纤维细胞关键标志基因,多能性相关基因,关键中心基因相对表达水平与转录组学测序结果基本保持一致。上述结果表明“VPTFN”小分子化合物组合可能将山羊成纤维细胞诱导转分化为一类呈现激活状态或者中间态细胞群。