论文部分内容阅读
目的:肺癌发病率及死亡率在全球呈现逐年上升趋势。肺癌以发现晚,生存期短为特征。虽然积极的手术治疗及靶向药物的发展在一定程度上改善了患者的无病生存期及5年生存率,但是提高并不明显。Rac3(ras-related C3 botulinum toxin substrate 3)在多种恶性肿瘤中调控细胞凋亡、细胞周期、侵袭迁移等恶性行为。本课题组在前期研究中对Rac3在肺腺癌中的表达进行了检测,对肺癌细胞凋亡、增殖、侵袭及转移进行了观察,并探讨了其作用机制,自噬是细胞程序化死亡的最重要因素之一,也是细胞自我更新的机制之一,对其调控机制进行探讨是肺癌研究的重要方向。本研究拟观察Rac3对肺腺癌细胞自噬的影响,进一步深入研究其调控机制,目的在于为进一步深入研究Rac3在肺腺癌恶性行为中的调控机制提供基础研究数据,为肺癌诊断及预后评估提供新的分子标志物,为未来治疗提供新的靶向候选基因。研究方法:1.以Western blot及qRT-PCR检测Rac3在四株肺腺癌细胞株(A549、H1975、H358、NH-1299)中表达。2.对A549细胞给予转染LV-Rac3-RNAi敲减Rac3,H1299细胞给予转染pCMV-Rac3上调Rac3表达,免疫荧光法检测转染效率,Western blot及qRT-PCR验证转染后Rac3蛋白及mRNA表达。3.为了观察Rac3对肺腺癌细胞自噬的影响,以Rapamycin进行诱导自噬,通过观察Rac3被下调或上调后对自噬的影响观察Rac3在自噬中的作用,以Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62表达评估自噬水平。4.为了探讨Rac3对肺腺癌细胞自噬调控的机制,Western blot检测上调Rac3后对H1299细胞自噬通路相关蛋白表达的变化。5.为了进一步检测Rac3对mTOR通路的调控作用,在上调Rac3表达的H1299细胞通过氨基酸饥饿实验抑制mTOR通路,再通过氨基酸回补观察mTOR通路蛋白的变化,进一步验证Rac3对mTOR通路的调控作用。结果:1.肺腺癌细胞系(A549、H1975、H358、H-1299)Rac3蛋白及mRNA水平均有表达,A549中蛋白及mRNA表达水平最高(P<0.05),H-1299中表达最低(P<0.05)。2.A549细胞给予转染LV-Rac3-RNAi敲减Rac3表达,荧光显微镜下观察,转染效率约为90%,H1299细胞给予转染pCMV-Rac3上调Rac3表达,荧光显微镜下观察,转染效率约为90%;3.给予不同浓度Rapamycin诱导Rac3敲减的A549细胞自噬,与对照组比较,在1μm/ml浓度LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,p62蛋白表达降低(P<0.01),下调Rac3对Rapamycin诱导的自噬具有促进作用。4.给予不同浓度Rapamycin诱导Rac3过表达的H1299细胞自噬,与对照组比较,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低,p62升高(P<0.01),上调Rac3表达对Rapamycin诱导的自噬具有抑制作用。5.在H1299细胞上调Rac3表达后检测自噬通路相关蛋白表达,Western blot显示,p-mTOR、p-ulk1、p-p70 S6K、p-S6蛋白表达水平升高(P<0.05),这表明,上调Rac3可能通过mTOR、p70 S6K、S6及ulk的磷酸化激活mTOR通路抑制自噬。6.在上调Rac3表达的H1299细胞通过氨基酸饥饿实验抑制mTOR通路,再通过氨基酸回补观察mTOR通路蛋白的变化,进一步验证Rac3是否对mTOR通路具有调控作用。氨基酸饥饿实验显示,氨基酸饥饿抑制了Rac3过表达诱导的mTOR、p70 S6K及S6的磷酸化,而回补氨基酸能够部分恢复mTOR、p70 S6K及S6磷酸化水平,这进一步表明,上调Rac3能够激活mTOR通路,从而抑制自噬。结论:1.下调Rac3对雷帕霉素诱导肺癌A549细胞自噬具有促进作用,上调Rac3对雷帕霉素诱导肺癌H1299细胞自噬具有抑制作用。2.上调Rac3通过激活mTOR通路抑制肺癌细胞H1299自噬。