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目的:肠道菌群与Ⅱ型糖尿病(T2D)发生发展密切相关。肠道菌群的失调会引起肠渗透性的增加,促使脂多糖等毒性物质透过肠粘膜系统进入血液,引起胰岛素敏感器官的低度炎症及胰岛素抵抗,加速糖尿病进程。益生菌能通过调节肠道菌群发挥抗糖尿病作用。前期研究已初步明确乳源性复合益生菌发酵的驼乳能改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠血糖及血脂代谢,其可能与促进胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌有关,但乳源性复合益生菌是否具有抗糖尿病作用以及其可能的抗糖尿病分子机制仍不明确。本研究首先探讨乳源性复合益生菌的抗糖尿病药效学作用;其次探讨乳源性复合益生菌对肠道菌群的影响,最后探讨乳源性复合益生菌诱导结肠GLP-1分泌以及M2极化的分子机制研究。方法:第一部分:以C57BL/Ks小鼠作为正常对照组。以db/db小鼠作为T2D模型组。实验分为正常组、模型组、二甲双胍组、利拉鲁肽组、低剂量及高剂量乳源性复合益生菌组。所有组平行操作干预六周。试剂盒检测各组鼠血糖参数(FBG、OGTT、AUC、Hb Alc、C肽)及血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C)参数指标,HE染色观察胰腺、肝脏、附睾白色脂肪组织形态,验证乳源性复合益生菌的抗糖尿病药效学作用。第二部分:提取各组鼠粪便细菌总DNA,琼脂糖凝胶电泳及核酸蛋白仪检测细菌总DNA纯度及浓度,q RT-PCR构建目标菌群标准曲线及检测目标菌群含量,明确乳源性复合益生菌对肠道菌群的调节作用。第三部分(一):1)气相色谱法检测粪便中乙酸、丙酸及丁酸含量,Elisa、q RT-PCR及Western blot分别检测血浆GLP-1含量、GLP-1R基因以及GLP-1蛋白表达,q RT-PCR检测结肠组织前胰高血糖素(GCG)、前激素转化酶1/3(PC1/3)、G蛋白偶联受体43(GPR43)、GPR41m RNA表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过激活短链脂肪酸受体GPR43及GPR41活性,并上调GCG、PC1/3 m RNA表达,诱导GLP-1分泌;2)Western blot及免疫组化法检测胰腺组织炎症因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ、NF-κB、p-NF-κB、ICAM-1、VCAM-1)表达,Elisa法检测血清抗氧化物酶(SOD、CAT及GSH/GSSG)活性,免疫组化法检测胰腺组织insulin蛋白表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过抗炎、抗氧化作用改善胰腺功能;3)Western blot及免疫组化法检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K及AKT)表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡。第三部分(二):1)试剂盒检测粪便及血清中脂多糖(LPS)含量,免疫组化法检测结肠炎症因子(ICAM-1、VCAM-1、NF-κB、p-NF-κB)表达,q RT-PCR及免疫组化法检测紧密连接蛋白及黏蛋白(Claudin-1、Occludin-1、ZO-1、Mucin-2)表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过减少LPS生成,抑制炎症因子表达,增加紧密连接蛋白及黏蛋白表达,改善肠屏障功能;2)q RT-PCR检测结肠组织抗氧化酶(CAT、SOD1、GR、GSH-Px等)表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过抗氧化作用抑制结肠氧化应激损伤;3)q RT-PCR及western blot检测M1极化因子(IL-1β、TNF-α、IFN-γ等)、M2极化因子(IL-10、Arg-1、TGF-β等)及TLRs/My D88/NF-κB表达,明确乳源性复合益生菌是否能通过TLRs/My D88/NF-κB信号通路诱导结肠M2型极化。结果:第一部分:1)乳源性复合益生菌降低FBG、Hb A1c含量,升高C-肽含量及口服葡萄糖耐受能力,具有降血糖作用;2)乳源性复合益生菌降低TG、TC、LDL-C含量,具有降血脂作用;3)HE染色结果显示,乳源性复合益生菌显著改善db/db鼠胰腺、肝脏及脂肪形态。第二部分:1)乳源性复合益生菌显著减少Firmicutes/Bacteroidetes、革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)、大肠埃希菌属(Escherichia coli)含量;2)乳源性复合益生菌对革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)及屎肠球菌(Enterococcus faecium)无影响。3)乳源性复合益生菌显著增加db/db鼠产短链脂肪酸菌,包括乳酸杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、罗斯伯里氏菌属(Roseburia)、柔嫩梭菌属(Clostridium leptum)、普氏菌属(Prevotella);第三部分(一):1)乳源性复合益生菌显著增加丙酸及丁酸含量,上调GPR43、GPR41、GCG、PC1/3m RNA表达,增加结肠GLP-1分泌;2)乳源性复合益生菌抑制炎症因子及黏附分子(NF-κB、p-NF-κB、ICAM-1、VCAM-1)表达,增加血清抗氧化物酶(CAT、SOD、GSH/GSSG)活性,改善胰腺功能;3)乳源性复合益生菌激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡。第三部分(二):1)乳源性复合益生菌减少血清及粪便LPS含量,抑制粘附(ICAM-1、VCAM-1)表达、促进紧密连接蛋白及黏蛋白(Claudin-1、Occludin-1、ZO-1、Mucin-2)表达,改善肠道屏障功能;2)乳源性复合益生菌促进结肠抗氧化物酶CAT、SOD1、GSH-Px m RNA表达,下调i NOS及COX-2 m RNA表达,抑制结肠氧化应激损伤;3)乳源性复合益生菌能抑制TLRs/My D88/NF-κB信号通路,诱导结肠由M1型促炎极化转为M2型抗炎极化。结论:1)乳源性复合益生菌有效降低db/db鼠血糖及血脂,改善胰腺、肝脏、附睾白色脂肪形态,具有抗糖尿病药效学的作用;2)乳源性复合益生菌显著增加产短链脂肪酸菌群及其代谢产物丙酸及丁酸,激活GPR43及GPR41活性,并增加GCG及PC1/3m RNA表达,促进GLP-1分泌;3)乳源性复合益生菌能增加血清抗氧化物酶活性,抑制炎症因子表达,以及激活PI3K/AKT信号通路抑制胰腺凋亡,促进胰岛素分泌;4)乳源性复合益生菌显著减少革兰氏阴性菌及其代谢产物LPS含量,增加结肠抗氧化物酶活性,抑制黏附分子表达,上调紧密连接蛋白及黏蛋白表达,改善肠道屏障功能,并通过抑制TLRs/My D88/NF-κB信号通路诱导结肠M2型极化。