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背景与目的:Epstein-Barr病毒相关胃癌（Epstein-Barr virus associated gastric cancer,EBVaGC）是与EB病毒感染有关的胃癌,是TCGA定义的胃癌分子分型的4个亚型之一,约占胃癌的1.3~30.9%。EB病毒Bam-HI-A右向转录编码的微小RNA（EBV Bam-HI-A rightward transcripts miRNAs,EBV BART miRNAs）被认为是EBV相关肿瘤发病机制中的关键因素,EBV基因组编码25个pre-miRNA前体和44个成熟的miRNAs。本课题组前期对EBV相关人源性淋巴瘤小鼠模型进行miRNA芯片筛查,发现EBV-miR-BART19-3p显著上调。目前关于EBVmiR-BART19-3p在EBV相关胃癌中的作用尚不清楚。本研究拟收集EBV相关胃癌患者组织标本和临床资料,检测明确EBV-miRBART19-3p在EBV相关胃癌中的表达情况;利用细胞和分子生物学技术,通过体内外实验研究EBV-miR-BART19-3p在EBV相关胃癌中的生物学功能及其作用机制。第一章EBV-miR-BART19-3p在人胃癌组织和胃癌细胞系中的表达方法:从南华大学附属第一医院收集胃癌患者手术切除的癌和配对的正常胃粘膜新鲜组织,利用EBER原位杂交检测EBV感染情况。从配对的胃癌和正常胃粘膜提取DNA进行PCR凝胶电泳检测EB病毒EBNA1基因。从中筛选EBV阳性胃癌提取RNA,用RT-q PCR检测EBV-miR-BART19-3p在EBV相关胃癌中的表达水平。对EBV阴性胃癌细胞系AGS、永生化胃粘膜上皮细胞系GES1、EBV阳性胃癌细胞系AGS-EBV进行EBNA1检测,再用RT-q PCR检测EBV-miR-BART19-3p在上述细胞系中的表达水平。结果:本研究共收集95例胃癌患者的胃癌组织及其配对的正常胃粘膜组织,经检测EBER和EBNA1证实5例为EBVaGC,在收集的胃癌中占比5.26%（5/95例）。RT-q PCR检测显示EBV-miRBART19-3p在EBV相关胃癌患者的癌组织中相对正常胃粘膜显著高表达,差异具有统计学意义。PCR检测显示AGS、GES1细胞系中EBNA1阴性;AGS-EBV细胞系中EBNA1呈阳性。RTq PCR显示EBV-miR-BART19-3p在EBV阴性胃癌细胞系AGS,永生化胃粘膜上皮细胞系GES1中无表达,在EBV阳性胃癌细胞系AGS-EBV中EBV-miR-BART19-3p高表达。第二章EBV-miR-BART19-3p对胃癌细胞和永生化胃粘膜上皮细胞增殖及侵袭迁移能力的影响方法:以EBV阴性胃癌细胞AGS、永生化胃粘膜上皮细胞GES1及EBV阳性胃癌AGS-EBV细胞系为体外细胞模型研究对象,采用NC/BART19-3p mimics瞬时转染及慢病毒稳定感染技术,对EBV阴性胃癌细胞系AGS及永生化胃粘膜上皮细胞系GES1构建过表达EBV-miR-BART19-3p细胞模型;采用NC/BART19-3p antagomir瞬时转染及慢病毒稳定感染技术,对EBV阳性胃癌细胞系AGS-EBV构建敲低EBV-miR-BART19-3p细胞模型,然后进行下列体外实验:用CCK8、克隆形成、Ed U检测过表达/敲低EBVmiR-BART19-3p对胃癌细胞及永生化胃粘膜上皮细胞增殖的作用;用划痕实验、Transwell迁移侵袭实验检测过表达/敲低EBV-miRBART19-3p对胃癌细胞及永生化胃粘膜上皮细胞迁移侵袭的作用;用流式细胞技术检测过表达/敲低EBV-miR-BART19-3p对胃癌细胞和永生化胃粘膜上皮细胞周期及细胞凋亡的影响。利用BALB/C裸鼠为体内实验研究对象,根据干预措施分成AGS-LV-NC组,AGS-LV-miR-BART19-3p组,AGS-LV-miRBART19-3p+antagomir组共3组,构建裸鼠体内皮下胃癌移植瘤模型,成瘤后给予瘤内注射miR-BART19-3p antagomir干预,观察移植瘤生长,用免疫组化检测3组裸鼠皮下成瘤组织Ki67及PCNA表达水平。结果:1.RT-q PCR检测显示LV-BART19-3p/BART19-3p mimics较LVNC/NC mimics明显增高,证明过表达EBV-miR-BART19-3p细胞系构建成功。RT-q PCR检测显示LV-BART19-3p inhibition与LVNC inhibition比较明显减低,提示敲低EBV-miR-BART19-3p细胞系构建成功。2.CCK8、克隆形成及Ed U结果显示在过表达EBV-miRBART19-3p后AGS及GES1细胞增殖活力增加,细胞克隆集落增多,DNA复制增多;在敲低EBV-miR-BART19-3p后AGS-EBV细胞的增殖活力减少,细胞克隆集落数减少,DNA复制减少。3.划痕实验、Transwell迁移侵袭结果显示过表达EBV-miRBART19-3p后AGS及GES1迁移侵袭能力增加;敲低EBV-miRBART19-3p后AGS-EBV细胞迁移侵袭能力降低。4.流式细胞仪检测显示过表达EBV-miR-BART19-3p能降低AGS及GES1细胞周期G2/M期比例,敲低EBV-miR-BART19-3p能增加AGS-EBV细胞周期G2/M期比例。流式细胞仪检测显示未使用凋亡诱导剂下,过表达EBV-miR-BART19-3p对AGS及GES1细胞的凋亡率无明显影响。5.裸鼠成瘤体积生长曲线及肿瘤重量观测显示过表达EBV-miRBART19-3p组与NC组相比小鼠肿瘤体积和重量显著增加,瘤内注射BART19-3p antagomir能部分回复EBV-miR-BART19-3p对胃癌肿瘤的生长促进作用。6.裸鼠皮下移植瘤3组的免疫组化染色显示LV-BART19-3p组Ki67、PCNA表达水平为+++++,LV-NC组Ki67、PCNA表达水平为-+,LV-BART19-3p+antagomir组Ki67、PCNA表达水平为+++。第三章EBV-miR-BART19-3p促进胃癌细胞及永生化胃粘膜上皮细胞增殖的机制研究方法:对AGS-EBV细胞进行敲低EBV-miR-BART19-3p处理,用转录本高通量测序技术获得差异表达基因列表,然后利用R语言及生物信息学分析从中筛选获得EBV-miR-BART19-3p下游5个候选靶基因,进一步通过RT-q PCR、双荧光素酶报告基因、Western Blot检测并验证出EBV-miR-BART19-3p的靶基因。同时利用KEGG通路和GO富集分析差异表达基因富集的功能表型。依据文献报道GADD45B与细胞周期G2/M阻滞相关,本课题进一步构建pc DNA3.1-GADD45B过表达载体,在LV-BART19-3p过表达稳转细胞系中同时过表达GADD45B,利用CCK8、克隆形成及Ed U实验检测过表达GADD45B回复EBV-miR-BART19-3p对细胞增殖的影响;Western Blot检测过表达GADD45B回复EBV-miR-BART19-3p对细胞增殖蛋白PCNA、Ki67的影响;Western Blot检测过表达GADD45B回复EBV-miR-BART19-3p与细胞G2/M期蛋白cyclin B、CDK1表达水平的关系。结果:1.转录本高通量测序发现敲低EBV-miR-BART19-3p后得到206个表达上调差异基因,99个表达下调差异基因。KEGG通路富集分析表明上调差异基因富集在cell cycle和Pathway in cancer。R语言及生物信息学分析从差异基因列表中筛选得到GADD45B、FOSB、RASD1、ATF3和CCDC80共5个潜在靶基因。RT-q PCR及双荧光素酶报告基因检测表明EBV-miR-BART19-3p直接靶向GADD45B基因。Western Blot检测显示EBV-miR-BART19-3p能抑制GADD45B蛋白表达。2.CCK8、克隆形成及Ed U回复实验显示,GADD45B能回复EBV-miR-BART19-3p对胃癌细胞增殖的促进作用,Western Blot检测表明GADD45B能回复EBV-miR-BART19-3p对增殖标志物PCNA、Ki67蛋白的上调作用;GADD45B能回复EBV-miRBART19-3p对胃癌细胞G2/M期蛋白cyclin B1上调作用,但不影响CDK1蛋白表达。结论:1.EBV-miR-BART19-3p在EBV相关胃癌组织中高表达,而在配对的正常胃粘膜组织中不表达。2.EBV-miR-BART19-3p促进胃癌细胞增殖及迁移侵袭,促进细胞周期。3.EBV-miR-BART19-3p直接靶向GADD45B基因3’UTR并抑制GADD45B的表达。EBV-miR-BART19-3p通过抑制GADD45B促进胃癌细胞增殖,减低胃癌细胞G2/M期阻滞。