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目的建立急性一氧化碳中毒迟发性脑病(Delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning,DEACMP)大鼠模型,用枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides,LBP)干预该模型,检测其诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)、神经型一氧化氮合酶(Neuronal nitric oxide synthase,nNOS)的表达及其与神经元变性坏死的相关性分析,探讨iNOS、nNOS蛋白在DEACMP发病机制中的作用以及LBP对DEACMP神经保护作用的初步研究。方法1.DEACMP大鼠模型制备:采用改良式腹腔注射CO法建立DEACMP大鼠模型(首次注射99.99%CO纯品气体120mL·kg-1,后连续注射3次,每次按照首次剂量的2/3,间隔4h)。选择成年雄性SD大鼠,经过Morris水迷宫训练,剔除60s以上不能找到平台的大鼠,选取合格SD大鼠108只,随机分为DEACMP组、空气组、正常组,分别给予腹腔注射纯品CO气体、腹腔注射空气和腹腔不干预,每组36只。再根据造模前后6个时间筛选点(造模前、造模1d、造模7d、造模14d、造模21d、造模28d),将DEACMP组、空气组、正常组分别分成6个亚组,每个亚组6只。三组从首次染毒后2h开始至24h,监测动脉COHb浓度,行Morris水迷宫、HE染色观察海马CA3区变性坏死的神经元,进一步验证模型。2.iNOS、nNOS蛋白在海马表达及其与海马CA3区神经元变性坏死相关性:选择72只雄性SD大鼠,随机分为DEACMP组、正常组,每组36只。根据造模前后不同时间段,再将两组分为造模前、造模1d、造模7d、造模14d、造模21d、造模28d的6个亚组,在6个亚组的时间段上,行HE染色光镜下观察海马CA3区神经元变性坏死,行免疫组织化学法、Western blot方法检测海马iNOS、nNOS蛋白表达。相关性分析iNOS、nNOS蛋白表达与神经元变性坏死的相关性。3.LBP对DEACMP大鼠神经保护作用的初步研究:选择成年雄性SD大鼠,采用改良式腹腔注射CO法建立DEACMP大鼠模型。取99%枸杞多糖粉末500mg+10ml无菌生理盐水中,配成浓度为50mg/ml的溶液(备用)。于造模14d行Morris水迷宫筛选出DEACMP大鼠模型48只,随机分为正常组[n=12,不干预]、DEACMP组[n=12,无菌生理盐水]、LBP高剂量组[n=12,枸杞多糖溶液400mg·(kg·d)-1]、LBP中剂量组[n=12,枸杞多糖溶液200mg·(kg·d)-1]、LBP低剂量组[n=12,枸杞多糖溶液100mg·(kg·d)-1]。从DEACMP造模14d开始,根据不同分组,分别给予不干预、腹腔注射生理盐水、腹腔注射不同剂量的枸杞多糖溶液,每日1次,连续腹腔注射14d,至造模后28d取材,行HE染色光镜下观察海马CA3区神经元变性坏死,Western blot方法检测海马iNOS蛋白表达,相关性分析海马iNOS蛋白表达与其神经元变性坏死的相关性。结果1.DEACMP大鼠模型制备:(1)Morris水迷宫:在造模前、造模1d、造模7d,DEACMP组的平均潜伏期、穿越平台次数与正常组、空气组比较,差异均无统计学意义(P均>0.05),而在造模14d、造模21d、造模28d比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。正常组和空气组在造模前后6个时间点比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。(2)HE染色观察海马CA3区神经元变性坏死:DEACMP组的神经元变性坏死计数与正常组、空气组,在造模前、造模1d、造模7d比较,差异均无统计学意义(P均<0.05),而在造模14d、造模21d、造模28d比较,差异均有统计学意义(P均>0.05),正常组和空气组在造模前后6个时间点比较,差异均无统计学意义(P均>0.05)。(3)相关性分析:DEACMP组的平均潜伏期与其海马CA3区变性坏死的神经元计数的相关系数r=0.915,具有相关性(P<0.05)。2.iNOS、nNOS蛋白在海马表达及其与海马CA3区神经元变性坏死相关性:(1)免疫组织化学检测海马CA3区iNOS、nNOS蛋白表达:iNOS和nNOS阳性染色主要在细胞膜表达,显色呈棕色深染色的颗粒。两组iNOS蛋白在造模前、造模1d比较差异无统计学意义(P均>0.05),而在造模7d、造模14d、造模21d、造模28d比较,差异具有统计学意义(P均<0.05);两组nNOS蛋白在造模前、造模28d比较,差异无统计学意义(P均>0.05),而在造模1d、造模7d、造模14d、造模21d比较,差异具差异有统计学意义(P均<0.05)。(2)Western blot法检测海马iNOS、nNOS蛋白表达:DEACMP组iNOS蛋白在造模7d开始表达,从造模7d到造模28d呈增强趋势。在造模前、造模1d与正常组比较,差异无统计学意义(P均>0.05),而在造模7d、造模14d、造模21d、造模28d比较,差异具有统计学意义(P均<0.05);DEACMP组nNOS蛋白在造模1d开始表达,从造模1d到造模21d呈增强趋势,在造模前、造模28d与正常组比较,差异无统计学意义(P均>0.05),而在造模1d、造模7d、造模14d、造模21d比较,差异具有统计学意义(P均<0.05)。(3)相关性分析:iNOS蛋白表达水平与海马CA3区神经元变性坏死计数的相关系数r=0.661,具有相关性(P<0.05)。nNOS蛋白表达水平与海马CA3区神经元变性坏死计数的相关系数r=0.281,无相关性(P>0.05)。3.LBP对DEACMP大鼠神经保护作用的初步研究:(1)LBP对DEACMP海马CA3区神经元变性坏死的作用:DEACMP组的神经元变性坏死计数与LBP低剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05),与LBP中剂量组、LBP高剂量组比较,差异有统计学意义(P均<0.05)。(2)LBP对DEACMP海马iNOS蛋白表达的作用:DEACMP组的iNOS蛋白表达与LBP低剂量组比较,差异无统计学意义(P>0.05),与LBP中剂量组、LBP高剂量组比较,差异有统计学意义(P均<0.05)。(3)相关性分析:LBP干预后的海马iNOS蛋白表达与其神经元变性坏死计数的相关系数r=0.868,具有相关性(P<0.05)。结论1.连续腹腔注射染毒是一种实用的建立DEACMP大鼠模型的方法,能建立研究DEACMP机制的理想模型。Morris水迷宫是一种可以客观评价大鼠认知能力的行为学方法,可以作为判断是否发生DEACMP的可靠方法。2.iNOS在DEACMP海马中持续高表达,与海马CA3区神经元变性坏死计数呈正相关,说明iNOS在DEACMP的发病过程中起了重要作用;而nNOS在DEACMP海马中没有持续高表达,与海马CA3区神经元变性坏死无相关性。3.LBP能降低DEACMP组28d海马iNOS表达和减少海马CA3区神经元变形坏死计数,而起到的神经保护作用,LBP的神经保护作用可能是通过NO/NOS系统发挥作用。