目的：　　1.建立双尾彗星试验检测精子DNA完整性的方法学，并建立双尾彗星类型与精子DNA损伤的类型相关性。　　2.分析双尾彗星试验、染色质扩散试验和吖啶橙染色等方法学检测精子DNA完整性的性能差异。　　3.分析精子DNA单链损伤和双链损伤与男性不育的关系。　　方法：　　1.利用中性和碱性双相单细胞凝胶电泳技术检测精子DNA损伤的情况。通过用H2O2和AluI分别诱导DNA的单链断裂和双链断裂来验证X轴方向的彗星尾属于双链断裂，Y轴方向的彗星尾属于单链断裂。经SYBR GreenⅠ染色后，在荧光显微镜下观察精子细胞（彗星），拟通过彗星尾的方向判断精子DNA损伤的类型及程度。　　2.利用一份正常的精液标本分别进行批内和批间重复性检验，来作为双尾彗星试验的方法学性能评价。　　3.分别用双尾彗星试验、染色质扩散试验和吖啶橙染色三种方法学检测30例男性不育患者的精液标本，以评价三种方法学检测精子DNA完整性的性能差异。　　4.临床收集60例不育男性的精液标本和30正常生育男性捐献的精液标本，用双尾彗星试验检测精子DNA完整性，分析精子DNA完整性与男性不育的相关性。　　5.对79例泌尿生殖道支原体感染男性不育患者和30例正常生育男性进行双尾彗星试验分析精子DNA完整性，并分析用敏感抗生素治疗后精子DNA完整性有无变化。　　结果：　　1.通过优化双尾彗星试验的实验条件，我们选择普通载玻片作为试验用载玻片。试验中，我们选择将精子密度调整为1×105/ml以备后续试验使用。精子裂解后通过3次水洗的方法去掉裂解液中的高盐成分和去垢剂，3次水洗后，水洗液中氯离子浓度为0.2±0.02mol/L，达到水洗要求。　　2.双尾彗星实验共检测到9种彗星形态，分别代表9种精子DNA损伤类型。　　3.利用H2O2和限制性酶AluI分别诱导单链DNA和双链DNA的产生。随着H2O2浓度逐渐增加，单链DNA的断裂逐渐增多，显微镜下可见含Y轴彗星尾的精子数逐渐增多，差异有统计学意义(p＜0.05)。同样，随着AluI消化时间的延长，双链DNA的断裂增多，显微镜下可见含X轴彗星尾的精子数增多，差异有统计学意义(p＜0.05)。　　4.通过1例正常的精液标本和1例弱精症的精液标本分别进行批内和批间重复性检验。结果显示:正常精液标本DSB-DFI的批间和批内CV％分别为15.0％和10.7％，SSB-DFI的批间和批内CV分别为8.7％和6.9％;弱精症的精液标本SSB-DFI的批间和批内CV分别为5.8％和5.0％; DSB-DFI的批间和批内CV分别为5.1％和2.6％。　　5.双尾彗星试验、染色质扩散试验和吖啶橙染色检测了30例男性不育患者的精液标本，其DFI分别为43.3±8.46、38.7±5.7、41.3±9.4，三组结果比较无显著性差异(p＞0.05)，但只有双尾彗星试验可以检测精子单链损伤和DNA双链损伤。　　6.我们对60例男性不育患者和30例正常生育能力男性的精液进行双尾彗星试验，结果发现:男性不育组SSB-DFI为23.70±10.25％，正常生育能力男性组SSB-DFI为20.52±8.79％，两者无显著性差异(p＞0.05）。而男性不育组的DSB-DFI为26.60±5.83％，正常生育男性DSB-DFI为4.61±1.27％，两者差异显著(p＜0.01）。　　7.对79例泌尿生殖道支原体感染男性不育患者和30例正常生育男性进行双尾彗星试验，结果发现:泌尿生殖道感染男性不育者精子DNA DSB-DFI为28.2±4.36％，显著高于正常对照组的5.81±1.07％，而SSB-DFI在泌尿生殖道感染男性不育组和正常对照组分别为24.7±5.25％、20.18±7.09％，两组间无明显差异(p＞0.05)。随机抽取32例泌尿生殖道感染男性不育者进行抗感染治疗后，精子DNA SSB-DFI为21.6±9.7％，与治疗前的23.7±7.83％比较，两者无显著差异(p＞0.05)，而精子DNA DSB-DFI在抗感染治疗后由29.7±5.64％降为15.9±3.5％，具有明显降低趋势(p＜0.05)。　　结论：　　双尾彗星试验能够区分精子DNA损伤是单链损伤还是双链损伤，为评估男性的生育能力提供更加深入、有力的实验室依据，为男性不育提供更有价值的检测指标。