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目的: 1.建立双尾彗星试验检测精子DNA完整性的方法学,并建立双尾彗星类型与精子DNA损伤的类型相关性。 2.分析双尾彗星试验、染色质扩散试验和吖啶橙染色等方法学检测精子DNA完整性的性能差异。 3.分析精子DNA单链损伤和双链损伤与男性不育的关系。 方法: 1.利用中性和碱性双相单细胞凝胶电泳技术检测精子DNA损伤的情况。通过用H2O2和AluI分别诱导DNA的单链断裂和双链断裂来验证X轴方向的彗星尾属于双链断裂,Y轴方向的彗星尾属于单链断裂。经SYBR GreenⅠ染色后,在荧光显微镜下观察精子细胞(彗星),拟通过彗星尾的方向判断精子DNA损伤的类型及程度。 2.利用一份正常的精液标本分别进行批内和批间重复性检验,来作为双尾彗星试验的方法学性能评价。 3.分别用双尾彗星试验、染色质扩散试验和吖啶橙染色三种方法学检测30例男性不育患者的精液标本,以评价三种方法学检测精子DNA完整性的性能差异。 4.临床收集60例不育男性的精液标本和30正常生育男性捐献的精液标本,用双尾彗星试验检测精子DNA完整性,分析精子DNA完整性与男性不育的相关性。 5.对79例泌尿生殖道支原体感染男性不育患者和30例正常生育男性进行双尾彗星试验分析精子DNA完整性,并分析用敏感抗生素治疗后精子DNA完整性有无变化。 结果: 1.通过优化双尾彗星试验的实验条件,我们选择普通载玻片作为试验用载玻片。试验中,我们选择将精子密度调整为1×105/ml以备后续试验使用。精子裂解后通过3次水洗的方法去掉裂解液中的高盐成分和去垢剂,3次水洗后,水洗液中氯离子浓度为0.2±0.02mol/L,达到水洗要求。 2.双尾彗星实验共检测到9种彗星形态,分别代表9种精子DNA损伤类型。 3.利用H2O2和限制性酶AluI分别诱导单链DNA和双链DNA的产生。随着H2O2浓度逐渐增加,单链DNA的断裂逐渐增多,显微镜下可见含Y轴彗星尾的精子数逐渐增多,差异有统计学意义(p<0.05)。同样,随着AluI消化时间的延长,双链DNA的断裂增多,显微镜下可见含X轴彗星尾的精子数增多,差异有统计学意义(p<0.05)。 4.通过1例正常的精液标本和1例弱精症的精液标本分别进行批内和批间重复性检验。结果显示:正常精液标本DSB-DFI的批间和批内CV%分别为15.0%和10.7%,SSB-DFI的批间和批内CV分别为8.7%和6.9%;弱精症的精液标本SSB-DFI的批间和批内CV分别为5.8%和5.0%; DSB-DFI的批间和批内CV分别为5.1%和2.6%。 5.双尾彗星试验、染色质扩散试验和吖啶橙染色检测了30例男性不育患者的精液标本,其DFI分别为43.3±8.46、38.7±5.7、41.3±9.4,三组结果比较无显著性差异(p>0.05),但只有双尾彗星试验可以检测精子单链损伤和DNA双链损伤。 6.我们对60例男性不育患者和30例正常生育能力男性的精液进行双尾彗星试验,结果发现:男性不育组SSB-DFI为23.70±10.25%,正常生育能力男性组SSB-DFI为20.52±8.79%,两者无显著性差异(p>0.05)。而男性不育组的DSB-DFI为26.60±5.83%,正常生育男性DSB-DFI为4.61±1.27%,两者差异显著(p<0.01)。 7.对79例泌尿生殖道支原体感染男性不育患者和30例正常生育男性进行双尾彗星试验,结果发现:泌尿生殖道感染男性不育者精子DNA DSB-DFI为28.2±4.36%,显著高于正常对照组的5.81±1.07%,而SSB-DFI在泌尿生殖道感染男性不育组和正常对照组分别为24.7±5.25%、20.18±7.09%,两组间无明显差异(p>0.05)。随机抽取32例泌尿生殖道感染男性不育者进行抗感染治疗后,精子DNA SSB-DFI为21.6±9.7%,与治疗前的23.7±7.83%比较,两者无显著差异(p>0.05),而精子DNA DSB-DFI在抗感染治疗后由29.7±5.64%降为15.9±3.5%,具有明显降低趋势(p<0.05)。 结论: 双尾彗星试验能够区分精子DNA损伤是单链损伤还是双链损伤,为评估男性的生育能力提供更加深入、有力的实验室依据,为男性不育提供更有价值的检测指标。