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随着社会经济的发展和人口老龄化的到来,脑卒中已经成为临床常见病,其发病率、死亡率和致残率均较高,为社会和家庭带来了沉重的负担。缺血性脑卒中(Cerebral Ischemia)主要的病理特征表现为脑内动脉狭窄、闭塞所致急性脑血液循环障碍。能量衰竭、钙超载、氧化应激、兴奋性毒性、炎症、自噬和凋亡均在脑缺血的病理进程中发挥重要作用。脑卒中属于难治性疾病,在临床上尚没有十分有效的治疗手段,目前急性期治疗手段局限于r-tPA溶栓治疗,但仍然存在治疗时间窗狭窄,副作用多等问题。恢复期则着重于神经修复和血管再生。脑缺血后血管再生可以改善损伤区域尤其是缺血半影区的血液供应,增加氧和营养物的输送,减小梗死体积,再生血管周围的微环境,易化神经发生和突触形成,加速神经功能的恢复。目前,血管再生在改善脑卒中患者治疗和预后等方面发挥的重要作用日益受到关注,如何通过医疗干预促进梗死周围血管再生,为脑卒中的治疗开拓了新的研究方向。酪氨酸蛋白激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)是JAK/STAT家族中重要的信号通路,JAK/STAT在细胞增殖、分化、血管再生等方面发挥重要作用。缺血性脑卒中发生后,磷酸化的STAT3表达显著增加,参与神经炎症和血管新生等过程。研究发现,地黄单一活性成分梓醇可以上调脑缺血区VEGF及p-STAT3的表达,加速缺血脑区血管新生与重塑。此外,丹参多酚酸可通过JAK2/STAT3信号通路,调节血管生长因子VEGF、Ang-1、Ang-2水平,以促进脑缺血后血管生成,改善神经功能损伤。银杏内酯K(GinkgolideK,GK)是从银杏叶中提取出的一种新的化合物,与银杏内酯B(GinkgolideB,GB)的结构相似,属于二萜内酯类化合物。目前关于银杏内酯K在缺血性脑卒中的作用研究较少,主要集中在抗氧化应激和早期神经保护作用。本实验室前期研究发现在缺血性脑卒中急性期,银杏内酯K在同等剂量下,治疗效果优于银杏内酯B和白果内酯,表明GK作为一种新发现的银杏内酯类药物,具有独特的潜在优势,值得进一步探讨研究。目前市面上已有的银杏内酯类注射液,多用于恢复期活血通络,银杏内酯类药物除了在急性期发挥保护作用外,在恢复期也存在一个持久的促修复作用。而血管再生在缺血性脑卒中恢复期发挥关键的作用。银杏内酯K作为银杏内酯类药物之一,是否能够促进缺血性脑卒中修复期血管再生目前尚未见报道。本文旨在研究银杏内酯K对脑缺血再灌注修复期血管再生的调节作用及其相关机制。文章应用C57BL/6小鼠短暂性大脑中动脉阻塞(tMCAO)制备脑缺血再灌注模型,复灌后给予GK,14天后取材观察药物对小鼠神经运动功能和血管再生的影响;离体培养微血管内皮细胞探讨JAK2/STAT3通路和HIF-1α、VEGF在GK促血管再生中的作用。本工作阐明了 GK在脑缺血再灌注后修复期具有促进血管再生的效应,其作用机制与VEGF的上调和JAK2/STAT3通路的激活有关,为该药在缺血性脑卒中恢复期的临床应用积累了学术基础并提供了实验依据。目的:研究银杏内酯K(Ginkgolide K,GK)对小鼠局灶性脑缺血再灌注(tMCAO)损伤恢复期的保护作用及对血管再生的影响,探讨JAK2/STAT3通路和VEGF表达调控在银杏内酯K促进血管再生中的作用。方法:1)应用二月龄雄性C57BL/6小鼠,线栓法制备小鼠tMCAO模型,缺血1h后再灌,再灌1h后分别腹腔注射生理盐水、GK(3.5,7.0,14.0mg/kg)和GB(3.5 mg/kg),一日两次,连续给药十四天。于造模后第1、4、7、14天进行神经功能评分,第14天进行转棒、转角测试和MRI扫描,灌注取材后免疫组化观察IgG渗漏和collagen Ⅳ的形态变化,通过以上指标探索GK对脑缺血再灌注修复期神经运动功能和血脑屏障是否具有保护作用。2)第14天取材前应用多普勒血流检测仪进行脑血流监测,小鼠灌注取材后进行Glut1/Ki67免疫荧光共标,观察GK对脑缺血再灌注后血管再生的影响。3)应用2-3月龄小鼠制备tMCAO模型,根据前期结果选择GK(3.5 mg/kg,ip,bid,14d),于缺血1h后再灌,复灌1h后给药。14天后处死小鼠取缺血半影区脑组织,应用Western Blot检测HIF-1α、VEGF的表达,观察GK对HIF-1α、VEGF的影响。4)培养小鼠微血管内皮细胞bEnd3,预孵育GK(0.1、1、10、50、100μM)2h后OGD3h,复糖复氧24h后,采用MTT、LDH法检测不同浓度GK对b End3细胞活力的影响,筛选出GK最小有效浓度。5)培养b End3细胞,预孵育GK(10μM)2 h,OGD3 h,复糖复氧24 h后,收集细胞提取蛋白,WesternBlot检测HIF-1α、VEGF的表达,观察GK对以上蛋白表达的影响。6)培养bEnd3细胞,预孵育GK(10μM)2h,OGD3h,复糖复氧24h后,收集细胞提取蛋白,Western Blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表达,观察GK对b End3细胞中JAK2/STAT3通路的影响。7)培养bEnd3细胞,预孵育GK(10μM)2h,OGD3h,复糖复氧24h后,应用VEGF细胞免疫荧光观察GK对OGD后b End3细胞的形态学影响,以及给予JAK2抑制剂AG490后b End3细胞的形态学改变。8)培养 bEnd3 细胞,预孵育 GK(10μM)或 AG490(10μM)2h,OGD3 h,复糖复氧24 h后,收集细胞提取蛋白,Western Blot检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、HIF-1α、VEGF的表达,观察给予AG490后,GK对以上蛋白表达的影响。结果:1)GK(3.5,7.0,14.0 mg/kg)显著促进小鼠脑缺血再灌注14天后神经运动功能恢复,减小脑梗死体积和血脑屏障破坏,其中14.0 mg/kg的保护作用最显著。2)GK促进小鼠缺血半影区血管再生及缺血再灌注后损伤侧脑血流恢复。3)GK(3.5 mg/kg)显著上调tMCAO模型14天小鼠脑内HIF-1α、VEGF的水平。4)预孵育GK(10,50,100μM)显著改善bEnd3细胞活力。5)GK(10μM)显著增加OGD后bEnd3细胞内的HIF-1α、VEGF的表达。6)GK(10μM)显著促进OGD后b End3细胞内的JAK2、STAT3的磷酸化。7)VEGF细胞免疫荧光结果显示,bEnd3细胞在正常培养条件下呈梭状,排列紧凑有序,趋向于形成圆形管腔,OGD处理后,bEnd3细胞核肿胀,细胞间形成的圆形管腔被破坏,GK(10μM)改善细胞间紧密排列的破坏,促进圆形管腔的形成,AG490显著抑制GK的保护作用。8)AG490 预处理部分取消 GK 上调 p-JAK2、p-STAT3、HIF-1α、VEGF 表达水平的作用。结论:1)GK减轻小鼠脑缺血再灌注恢复期神经运动功能损伤,促进恢复期血管再生。2)GK通过激活JAK2/STAT3通路升高HIF-1α/VEGF的表达发挥促进血管再生的作用。综上所述,本文工作的创新之处在于:1)揭示银杏内酯K通过促进小鼠脑缺血再灌注后血管再生发挥修复期保护作用银杏内酯K可以促进小鼠修复期损伤侧半影区血管再生从而改善脑血流供应,减小脑梗死体积,促进神经功能和运动功能的修复。2)阐明银杏内酯K通过激活JAK2/STAT3通路升高HIF-1α/VEGF的表达发挥促血管再生作用脑缺血再灌注后,银杏内酯K能显著升高脑内HIF-1α、VEGF的表达,同时GK能改善小鼠微血管内皮细胞(bEnd3)OGD后的细胞活力,显著上调小鼠微血管内皮细胞OGD后p-JAK2、p-STAT3、HIF-1α、VEGF的表达,促进血管腔形成。