目的:骨关节炎是最常见的一种年龄相关的慢性关节疾病。目前的骨关节炎治疗以药物治疗为主,而其目的多局限于缓解症状,最常用的非甾体抗炎药尽管在临床一线取得了良好的临床疗效,但其对心血管和胃肠道的副作用的负面影响不容忽视,新型抗炎药物的研发迫在眉睫。近些年来发现一类名为“特殊促炎症消退介质”的药物在众多疾病模型中起到了强大广泛的抗炎的作用,其中保护素DX是其中的代表成员,在既往研究中体现其抗炎能力。同一家族的其他成员已经证明了在体外对关节炎进展的抑制,所以保护素DX在关节炎模型中的抗炎作用有待于进一步探究。NF-κB作为经典的炎症通路,已被证明是许多抗骨关节药物的治疗作用机制,而AMPK这一广泛存在于组织中的经典蛋白在以往的研究中表现出与保护素DX紧密的联系,AMPK/NF-κB通路是否是保护素DX的治疗机制有待于进一步的探究。以上研究将为新型药物治疗骨关节炎提供理论研究基础。研究方法:第一部分材料选用大鼠原代软骨细胞进行研究,首先进行培养鉴定,再次进行不同浓度不同时间的保护素DX(Protectin DX,PDX)选取最适合的浓度梯度,然后用ELISA、Western bloting和PCR的方法检测炎症相关蛋白的表达和基因转录水平变化情况。第二部分材料选用大鼠原代滑膜成纤维细胞进行研究,首先进行培养鉴定,再次进行不同浓度不同时间的PDX选取最适合的浓度梯度,然后用同第一部分的方法检验炎症相关蛋白和基因转录水平变化情况,然后用Western blot和细胞免疫荧光的方法检测是否在滑膜成纤维细胞中发现其NF-κB p65核转位的情况。第三部分对膝关节腔注射碘乙酸建立大鼠膝关节骨关节炎模型,然后分空白组、OA组、OA+PDX组进行给药、取材,进行组织学、影像学、免疫印迹分析,检测PDX在体内对骨关节炎的治疗作用。第四部分材料选用大鼠原代软骨细胞进行研究,根据第一部分结果选取抗炎作用最大的浓度,用ELISA、Western blot和细胞免疫荧光的方法,在IL-1β基础上施加PDX或NF-κB抑制剂PDTC,探究NF-κB与下游蛋白的联系,然后相同条件下进一步施加PDX和或AMPK抑制剂compound C,探究AMPK激活与NF-κB和下游炎症相关蛋白的联系。结果:第一部分:保护素DX对炎症模型大鼠原代软骨细胞的治疗作用1.在24h和48h分别干预后,PDX在0.5、1、2和4μM浓度下细胞活力与空白组相比无差异,而在8μM浓度下,细胞活力明显降低。所以0.5、1、2和4μM的PDX浓度可以作为后续实验的工作浓度。2.在向软骨细胞施加IL-1β(10ng/ml)后,发现细胞活力明显降低,但在给予递增梯度浓度的PDX后,软骨细胞活性得以改善。3.IL-1β明显刺激大鼠软骨细胞分泌NO,但在此基础上给予递增浓度梯度PDX后NO逐渐降低。4.IL-1β明显刺激大鼠软骨细胞分泌PGE2,但在此基础上给予递增浓度梯度PDX后PGE2逐渐降低。5.在给予除空白组外各组IL-1β(10 ng/ml)的炎性刺激下,对干预组给予递增浓度梯度的PDX(1、2和4μM),RT-q PCR检测炎症相关基因m RNA水平发现IL-1β明显刺激软骨细胞炎症相关m RNA表达增加,但在此基础上给予递增浓度梯度的PDX后其炎症相关m RNA表达量逐渐降低,有统计学意义。6.在给予除空白组外各组IL-1β(10 ng/ml)的炎性刺激下,对干预组给予递增浓度梯度的PDX(1、2和4μM),Western blotting检测炎症相关蛋白水平发现IL-1β明显刺激软骨细胞炎症相关蛋白(i NOS、COX-2、MMP3、MMP13、ADAMTS4、COLLAGEN II)表达量增加,但在此基础上给予递增浓度梯度的PDX后其炎症相关蛋白表达量逐渐降低,有统计学意义。第二部分:保护素DX对炎症模型大鼠原代滑膜成纤维细胞的治疗作用1.24h和48h后,PDX在0.25、0.5、1、2μM浓度梯度中细胞活力与空白组相比无差异,而在4μM浓度下,细胞活力明显降低。所以0.5、1和2μM的PDX浓度可以作为后续实验的工作浓度。2.IL-1β刺激大鼠滑膜成纤维细胞分泌NO,此基础上给予递增浓度梯度PDX后NO表达量逐渐降低。3.IL-1β明显刺激大鼠滑膜成纤维细胞分泌PGE2,但在此基础上给予递增浓度梯度的PDX后PGE2表达量逐渐降低。4.RT-qPCR检测mRNA水平发现IL-1β明显使大鼠滑膜成纤维细胞炎症相关mRNA表达增加,但在此基础上给予递增浓度梯度的PDX后其炎症相关m RNA表达量逐渐降低,有统计学意义。5.Western blotting检测炎症的相关蛋白水平发现IL-1β明显刺激大鼠滑膜成纤维细胞炎症相关蛋白(i NOS、COX-2和MMP3、MMP13)表达量增加,但在此基础上给予递增浓度梯度的PDX后其炎症相关蛋白表达量逐渐降低,有统计学意义。6.IL-1β(5 ng/ml)刺激后,滑膜成纤维细胞发生NF-κB核转位,而在PDX刺激下,滑膜成纤维细胞核转位现象被逆转,重新分布在细胞核外,和IL-1β相比有明显区别。第三部分:保护素DX对炎症模型大鼠膝关节的治疗作用1.OA组明显软骨及周围组织被破坏,而给予PDX腹腔注射组明显看到组织条件改善。2.HE和翻红固绿染色、OARSI评分结果表现OA组较相对于空白组关节破坏严重,而PDX的加入明显改善了这种炎症破坏。3.通过用ELISA检测血清和关节腔灌洗液的TNF-α结果显示在血清和关节腔灌洗液中OA组TNF-α的水平最高,在OA+PDX组降低。4.Western blot实验显示在II型胶原在空白组表达最多,OA组明显减少,PDX的加入改善软骨的破坏,MMP13的WB结果也证明了PDX的体内抗炎作用。第四部分:保护素DX治疗炎症模型大鼠原代软骨细胞机制研究1.IL-1β处理后NF-κB p65和IκBα的磷酸化水平明显升高,而且IL-1β导致了IκBα明显降解。然而,PDX可以剂量依赖地抑制IL-1β介导的NF-κB p65和IκBα磷酸化升高。2.细胞中加入NF-κB的选择性抑制剂PDTC,可以部分地抑制IL-1β介导的炎性反应,i NOS,MMP13和NO的指标均在PDX施加后明显降低。3.AMPK的磷酸化水平被IL-1β降低,然后其水平被PDX升高。同时Compound C减轻了PDX导致的AMPK活化程度。在相同条件下,p65的磷酸化水平被IL-1β刺激升高,然后被PDX抑制。在此基础上加入Compound C后NF‐κB p65的活化水平被降低。同样,MMP13这一重要的炎症蛋白的变化同P65一样。4.多数P65在空白组的胞浆中存在,在IL-1β刺激后p65核内移表现出来,而PDX可以阻断这种表现并将p65重新转移到胞浆。进一步在此基础上compound C逆转了前面的核外移现象。结论:1.大鼠原代软骨细胞对浓度为1、2、4μM的PDX没有细胞毒性反应,IL-1β(10ng/ml)对大鼠原代软骨细胞增殖有明显的抑制作用,而PDX可以改善其对软骨细胞活力的抑制。2.在IL-1β诱导炎性反应的情况下,PDX可以改善其引起软骨基质成分的合成分泌以及降解的功能改变。3.在IL-1β诱导炎性反应的情况下,PDX可以改善其引起滑膜成纤维细胞表型的改变,尤其是对软骨基质成分的合成分泌以及降解的炎性介质和机制降解酶的改变。4.PDX可通过抑制滑膜成纤维细胞内NF-κB向核内转位而发挥抗炎作用。5.碘乙酸膝关节腔注射可以引起膝关节炎症改变,而腹腔注射PDX可以减轻其带来的膝关节局部和全身的炎症反应。6.在IL-1β介导炎性反应的情况下,PDX可阻断NF-κB信号通路的活化。7.PDX可通过AMPK/NF-κB信号通路发挥其抗炎作用。