纳米材料是一种新兴的材料,由于其广泛的用途,近年来正在飞速发展,并且越来越多地出现在人们的日常生活中。其中纳米氧化锌由于其应用范围广,生产技术成熟,商业化程度高,是人们接触最多的纳米材料之一。运用蛋白质组学技术研究纳米氧化锌对细胞蛋白质组造成的影响,有助于更好地掌握细胞对金属氧化物纳米粒子响应的整体变化,对研究细胞稳态调节机制以及理解纳米颗粒的毒性机理具有重要意义。本论文以A549细胞系为细胞模型,使用CCK-8法测定不同浓度纳米氧化锌的细胞毒性,并使用流式细胞术进行验证。之后运用iTRAQ这一高通量的蛋白组学技术,研究A549暴露于亚细胞毒性浓度的纳米氧化锌不同时间后细胞内蛋白质组的响应模式,再通过Western blot技术,深入研究我们感兴趣的蛋白质。同时,采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平,并测定细胞内总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的含量,用以评估细胞内的氧化压力。使用CCK-8法与流式细胞术测定不同浓度纳米氧化锌的细胞毒性,并通过与硫酸锌细胞毒性的比较,发现纳米氧化锌与锌离子尽管在低浓度下表现出非常相似的细胞毒性,但是在高浓度下的细胞毒性有较大差异,表明纳米氧化锌的毒性机理与锌离子并不完全相同。通过iTRAQ方法检测细胞蛋白质组,我们发现刺激9小时后发生差异表达的蛋白远远多于24小时后,并且大部分蛋白的变化趋势是先发生下调然后逐渐上调,揭示了刺激时间在研究纳米氧化锌毒性机理中的重要性。此外还对鉴定的差异表达蛋白质进行了生物过程等生物信息学分析,以帮助我们理解纳米氧化锌刺激涉及的细胞内的信号转导过程。细胞内ROS和谷胱甘肽实验表明,纳米氧化锌刺激9小时后细胞内会受到较高的氧化压力,进而证明纳米颗粒本身产生的毒性在纳米氧化锌毒性机理中的重要性。Western blot结果中,NF-κB p65与PNPase的表达在刺激9小时后的显著上升进一步证明纳米颗粒产生的毒性的重要性。另一方面,HSP90的表达在刺激9小时后上升而在24小时后降低至未受刺激的水平,表明细胞对纳米氧化锌整体毒性的响应已经使细胞内稳态基本达到平衡。我们根据实验结果推测,纳米粒子的毒性应该由颗粒和解离出的离子共同构成,在较低的浓度下,细胞短期内会受到颗粒与离子共同产生的毒性,而随着时间推移,细胞会自发调节自身稳态平衡,纳米颗粒产生的毒性会较快的被减弱或者清除,而解离出的离子细胞需要较长的时间去平衡,因此金属离子产生的毒性会占据主要地位。这一结果揭示了在对纳米粒子的毒性机理研究中控制刺激时间的重要性,将对研究纳米材料毒性机理提供一个新的方向。