论文部分内容阅读
布鲁菌病是一种重要的人畜共患传染病,由布鲁菌入侵机体后引起,被列为我国法定传染病中的乙类传染病之首。人感染布病后主要表现为发热、关节痛、全身乏力,多汗等症状。而动物感染布病后主要表现为母畜流产,子宫炎,关节炎,睾丸炎等症状。该病不但对养殖业造成重大经济损失,同时也严重威胁食品安全和公共卫生。密度感应（Qurom Sensing,QS）是细菌通过自身产生小分子自诱导物（Autoinducer,AI）来协调群体行为的过程。QS系统的AI信号分子主要分为3类:第1类主要是革兰氏阴性菌使用的酰基高丝氨酸内酯类化合物类（Acyl-homoserine lactone,AHL）,又称为AI-1;第2类主要是革兰氏阳性菌使用的寡肽类信号分子;第3类是4,5-二羟基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione,DPD）类衍生物,又称为AI-2（Autoinducer-2,AI-2）。与前2类信号分子具有种属特异性不同的是,AI-2可用于细菌种群间的信息交流,因而被称为细菌交流的“通用语言”。AI-2来源于细菌的pfs/luxS型甲硫氨酸代谢通路（Activated methionine cycle,AMC）。此外,细菌中还存在sahH型甲硫氨酸代谢通路,该通路则是在S-腺苷高半胱氨酸水解酶（S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase,SahH）的催化下,通过一步反应将底物S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine,SAH）直接生成同型半胱氨酸（Homocysteine,HCY）,该过程不产生信号分子AI-2。那么布鲁菌采用何种通路进行AMC代谢,是否产生AI-2信号分子?为了回答上述问题,本研究首先开展了对布鲁菌的AI-2信号分子检测。1.布鲁菌中信号分子AI-2的检测及检测方法的优化运用哈维弧菌BB170（V.harveyi BB170）生物发光法检测信号分子AI-2,是目前应用最为广泛的方法,该方法具有简便、快捷等优点。但该方法易受检测条件影响。因此,本研究首先开展检测方法的优化,通过对哈维弧菌BB170生长曲线、待测菌株培养上清采集的最佳时间、不同培养基及抗生素等影响因素的分析,进而确定一个最为合适的V.harveyi BB170生物发光检测法。本研究结果表明BB170检测细菌AI-2信号分子的的最优条件是:哈维弧菌BB170用新鲜制备的MB培养培养至OD600=2.0;待测菌株培养至对数生长中期后,采集上清培养物用于AI-2信号分子检测;检测时将AB培养基和培养上清培养4-6h时,进行检测所得数据最佳（用含卡那抗性的MB培养基制备的BB152上清作为AI-2的阳性对照）。本研究中,对布鲁菌A19不同OD600值的培养上清进行的AI-2检测结果表明,布鲁菌检测不到AI-2信号分子活性,采用sahH型甲硫氨酸代谢通路。2.SahH在甲硫氨酸代谢通路中的催化活性及其影响因素分析为了进一步探讨SahH在甲硫氨酸代谢通路中的催化活性及功能,本研究构建了pET28a-sahH原核表达载体,转化BL21宿主菌后,经28℃诱导表达后,可在上清中大量表达重组蛋白SahH。对蛋白的纯化条件研究表明,用浓度为100mM-150mM咪唑进行洗脱,纯化效果最好;为了进一步研究SahH催化活性,将终浓度为1mg/mL的SahH与1mM的底物SAH共同作用,检测结果表明,SahH能催化底物产生浓度为100.2μM的同型半胱氨酸,对反应产物的AI-2活性检测结果表明,无AI-2活性。同时运用本实验室前期构建的禽致病性大肠杆菌的pET28a-luxS与pET28a-pfs原核表达载体,分别表达APEC-LuxS和APEC-Pfs作为阳性对照,结果表明,同样条件下能催化产生286.9μM的同型半胱氨酸,反应产物的AI-2活性检测结果表明具有AI-2活性。为了研究影响SahH催化活性的因素,分别对SahH酶的浓度、反应温度、热稳定性和辅酶NAD+的影响进行研究,结果表明,在SAH浓度为1 mM时,当SahH的浓度由1 mg/mL增加至4 mg/mL时,催化产物同型半胱氨酸的浓度由26.6增加至150.3μM（465%）,表明SahH酶蛋白浓度对其催化活性有显著影响;而添加外源性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）之后,其催化产物同型半胱氨酸由100.2μM下降至21.2μM（78.8%）,表明添加外源性NAD+对SahH的催化活性有明显抑制作用;分别将SahH酶蛋白于0℃,25℃,37℃,42℃,55℃,60℃,65℃,70℃,100℃不同温度下处理10 min,再进行体外催化活性实验,结果表明60℃之后SahH重组蛋白基本失活。3.蛋白修饰及催化活性位点对SahH催化活性的影响为了进一步研究蛋白修饰及催化活性位点对SahH催化活性的影响,运用上述建立的反应体系,对影响SahH活性的蛋白修饰及关键催化活性位点进行分析。（1）成功构建了含有SahH和NAD+激酶（NAD kinase）的双表达载pETDuet-sahH-gNAD,对含有上述质粒的重组菌BL21（pETDuet-sahH-gNAD）进行诱导表达,成功表达出SahH。对SahH进行体外催化反应,结果表明,当NADK与SahH进行共表达时,可使SahH催化底物形成产物同型半胱氨酸的浓度由单表达的18.6μM提高至50.4μM（170.9%）;（2）质谱结果表明,SahH中仅在第444位丝氨酸存在磷酸化位点。成功构建该位点突变的突变质粒pETDuet-sahH-M444,并对突变后的重组表达蛋白SahH进行催化活性分析,结果表明:突变后,其催化形成产物同型半胱氨酸浓度由100.2μM下降至21.8μM（78.24%）;（3）对鉴定的影响SahH构象的键位点337位和338位氨基酸分别进行单突变和双突变,成功构建单突变质粒pETDuet-sahH-M337和pETDuet-sahH-M338及双突变株pETDuet-sahH-M337-338。对各突变重组蛋白SahH进行体外催化反应。结果表明,突变之后,各突变重组SahH催化形成产物同型半胱氨酸浓度由100.2μM分别下降至1.6μM、13.8μM和4.5μM。通过本研究的开展,建立了V.harveyi BB170检测信号分子AI-2的最适方法,并运用其检测布鲁菌的AI-2活性,结果表明布鲁菌中无AI-2活性,采用SahH依赖的甲硫氨酸代谢通路。通过对影响SahH催化反应条件的优化,建立了其最适反应体系;在此基础上鉴定了SahH的催化活性位点。本研究将为进一步开展SahH功能研究奠定基础。