目的本课题拟在前期研究的基础上,以VEGF/PI3K/AKT信号通路为切入点,研究补肾安胎冲剂对RSA模型小鼠胎盘血管重铸的干预机制。通过观察蜕膜VEGF、VEGFR-2、s VEGFR-1、MAPK、HIF-1α、ES、RAS和MVD的表达及组织形态学的变化,检测VEGF、VEGF受体、促血管生成因子、抑血管生成因子、PI3K、AKT、p-AKT等m RNA的表达,探索补肾安胎冲剂对VEGF/PI3K/AKT信号通路的影响,揭示补肾健脾中药促进母胎界面血管重铸、保护妊娠的分子生物学机制,以丰富补肾健脾中药治疗RSA的科学内涵。方法通过文献研究,总结分析RSA小鼠母胎界面血管生成与脾肾的关系;从中医理论角度,阐释RSA小鼠子宫蜕膜组织血管生成“从脾肾论治”的机制。实验取雌性CBA/J小鼠50只,雄性DBA/2小鼠20只,雄性BALB/c小鼠5只,按2∶1比例合笼交配,检出阴栓者计为妊娠第0天,分别建立RSA模型CBA/J×DBA/2小鼠与正常妊娠模型CBA×BALB/c小鼠,按妊娠顺序随机分为正常组、模型组和黄体酮胶囊对照组、补肾安胎冲剂低剂量组和补肾安胎冲剂高剂量组,每组动物数均为8只。其中正常妊娠组、模型对照组分别予以蒸馏水灌胃,黄体酮胶囊组、补肾安胎冲剂低、高剂量组分别给予相应药物灌胃,连续15天,末次给药24h后,断颈处死孕鼠,剖视子宫观察各组小鼠胚胎丢失率,取其子宫蜕膜组织,病理形态学观察子宫蜕膜组织变化,免疫组化SP法检测蜕膜组织VEGF、VEGFR-2、s VEGFR-1、MAPK、HIF-1α、ES、RAS和MVD的表达,蛋白免疫印迹技术(Western Blotting)检测蜕膜组织MVD、HIF-1α、VEGF、ES及PI3K、AKT、p-AKT的表达,Q-PCR法检测蜕膜组织VEGF m RNA、VEGFR-2m RNA、s VEGFR-1 m RNA、Ras m RNA、MAPK m RNA、HIF-1αm RNA、ESm RNA的含量等。结果理论研究结果:1.母胎界面血管重铸是维持妊娠的关键。胎儿及胎盘的正常发育都主要取决于滋养细胞的分化和子宫-胎盘血管网络的构建。受精卵在着床过程之中,滋养细胞侵入子宫内膜和螺旋动脉,前者产生大量血管生成因子,后者逐渐取代内皮细胞,导致螺旋动脉扩张,不仅使植入部位的血流增加,而且使子宫内膜在短时间内迅速蜕膜化,在各种血管生长因子的共同调控下形成大量新生血管。2.血管新生是促进母胎界面血管重铸的本质。正常组织中由于缺少促血管生成刺激因子或者血管生成刺激因子被高水平血管生成抑制因子严格控制,促血管生成和抑制血管生成两者处于平衡状态;当促血管生长因子浓度上升,或者血管生成抑制因子浓度下降,都会打破血管生成的调节平衡,促血管生成因素处于优势从而引起血管生成过程。3.VEGF/PI3K/AKT信号通路调节促进母胎界面血管重铸。PI3K/AKT信号通路活化能通过多种途径上调低氧诱导因子-1α的表达,从而启动VEGF基因转录,促进VEGF表达。4.脾肾亏虚是RSA的重要病机。妊娠从着床到胎盘形成的整个过程不仅需要丰富的血液供应,而且都离不开血管新生、通透性改变,胚胎生长发育、妊娠成功的关键在于胎儿、胎盘及子宫蜕膜血管的生长发育,这就要求胎盘血管网需要充分发育才能满足母胎之间气体和养料的交换及胎儿代谢废物的排泄的需要。这些都与中医学“脾主运化”、“脾主升清”、“肾藏精,主生殖”等理论密切关联。5.健脾益肾是促进RSA母胎界面血管重铸的重要治则。补肾健脾法具有防治流产的确切疗效,补肾健脾中药补肾安胎冲剂能够促进血管的生成和发育,以维持正常的妊娠,为中药通过改善蜕膜血管生成方面而发挥其保胎作用机理提供了实验依据。实验研究结果:1.与正常妊娠小鼠相比,模型组RSA小鼠胚胎丢失率显著升高并具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性药组RSA小鼠胚胎丢失率显著降低并具有统计学意义(P<0.01)。2.与正常妊娠小鼠比较,模型组RSA小鼠绒毛形态呈现为大小不一,不规则状,合体滋养层细胞明显减少,细胞滋养层细胞也相对减少;模型组小鼠细胞可见萎缩变性,排列较为紊乱,并能观察到明显的凋亡细胞和炎性细胞;细胞核呈现固缩态,染色程度较深;间充质及基质纤维素样变性十分明显,间质血管也明显减少;此外,蜕膜组织变性明显,上皮有缺失,细胞排列凌乱,腺体呈皱缩状,血管可见明显瘀血。给予补肾安胎冲剂和黄体酮胶囊干预后,RSA小鼠蜕膜组织血管形态学呈现好转趋势。3.在各组小鼠蜕膜组织中,VEGF的表达主要见于蜕膜细胞、腺上皮细胞和血管内皮细胞胞浆中,细胞核着色不明显,蜕膜细胞阳性染色强;VEGFR-2在蜕膜组织的阳性表达位于大部分蜕膜细胞及少数腺上皮细胞的胞核和胞浆内;s VEGFR-1在血管内皮细胞中存在丰富的表达。模型组RSA小鼠VEGF、VEGFR-2的表达低于正常组、低剂量组、高剂量组及阳性药组;s VEGFR-1的表达高于正常组、低剂量组、高剂量组及阳性药组。4.与正常组相比,模型组RSA小鼠HIF-1α、VEGF、MVD蛋白表达显著降低、ES蛋白显著升高并具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组HIF-1α、VEGF、MVD 3种蛋的白表达升高、而ES蛋白则降低,并具有统计学差异(P<0.05)。5.与正常组比较,模型组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达显著升高并具有统计学意义(P<0.05)。6.与正常组相比,模型组RSA小鼠HIF-1α、VEGF m RNA表达显著降低、ES m RNA显著升高并具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组HIF-1α、VEGF m RNA表达显著升高、ES m RNA显著降低并具有统计学意义(P<0.05)。7.与正常组相比,模型组RSA小鼠RAS、MAPK、VEGF-R2 m RNA表达显著降低、SVEGF-R1 m RNA显著升高并具有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,低剂量组、高剂量组、阳性对照组Ras、MAPK、VEGF-R2m RNA表达显著升高、SVEGF-R1 m RNA显著降低并具有统计学意义(P<0.05)。结论RSA小鼠存在蜕膜血管新生障碍,且蜕膜血管新生与VEGF/PI3K/AKT表达有关。补肾安胎冲剂能明显改善RSA小鼠胚胎丢失率、促进蜕膜血管新生。补肾安胎冲剂改善RSA小鼠蜕膜血管新生的机制在于:1.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织细胞因子表达改善RSA小鼠血管新生:通过上调蜕膜血管VEGF、VEGFR-2、MAPK、HIF-1α、RAS和MVD蛋白表达,下调s VEGFR-1和ES蛋白表达,从而改善RSA小鼠蜕膜血管新生。2.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织VEGF/PI3K/AKT通路表达改善RSA小鼠蜕膜血管新生:通过上调蜕膜血管PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达,调节VEGF/PI3K/AKT通路表达,改善RSA小鼠胚胎丢失率和蜕膜血管新生。3.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织HIF-1α、VEGF、ES m RNA水平改善RSA小鼠蜕膜血管新生:通过上调蜕膜血管HIF-1α、VEGF m RNA表达,下调ES m RNA水平,改善RSA小鼠胚胎丢失率和蜕膜血管新生。4.补肾安胎冲剂通过调节蜕膜组织RAS、MAPK、VEGF-R2 m RNA、SVEGF-R1 m RNA水平改善RSA小鼠蜕膜血管新生:通过上调蜕膜血管Ras、MAPK、VEGF-R2 m RNA表达,下调SVEGF-R1 m RNA水平,改善RSA小鼠胚胎丢失率和蜕膜血管新生。