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目的:脊索瘤是一种脊柱原发性恶性肿瘤,约占所有骨恶性肿瘤的1-4%。脊索瘤对传统化学治疗和放射治疗并不敏感,而且手术治疗的难度大、并发症多且复发率高,因此现阶段脊索瘤的治疗需要新的更有效的治疗策略和方法。FTY720(芬戈莫德)是一种新型的免疫抑制剂,现阶段研究表明其具有明确的抗肿瘤作用,可以抑制多种恶性肿瘤的生长和转移,然而目前尚无FTY720在脊索瘤方面的研究报道。本研究首先在细胞水平探讨FTY720对脊索瘤细胞多种生物学行为的影响,之后进一步研究FTY720对脊索瘤抗肿瘤作用的相关机制,最后在动物模型中探讨FTY720对脊索瘤的治疗效果,进而为脊索瘤治疗寻找新的靶向治疗方法,为FTY720在脊索瘤的临床应用提供理论基础和依据。研究方法:首先,使用两种最常用的脊索瘤细胞系MUG-Chor1和U-CH1,以梯度浓度及梯度时间的FTY720处理细胞,以相应浓度的DMSO作为对照组,同时使用人成骨细胞系hFOB1.19作为正常细胞对照组,通过MTS实验分析药物对两种脊索瘤细胞和人成骨细胞增殖能力的影响,观察FTY720对脊索瘤细胞和正常细胞作用的差异性,计算两种脊索瘤细胞FTY720的半抑制浓度(IC50);通过集落形成实验检测经FTY20作用后MUG-Chor1和U-CH1的集落形成能力;使用EDU细胞增殖成像实验在细胞水平直观反应脊索瘤细胞经药物作用前后的DNA复制活性,进一步观察验证FTY720对两种细胞系增殖的影响。MUG-Chor1和U-CH1经过FTY720处理后,使用Transwell侵袭实验检测FTY720对两种细胞侵袭能力的影响,通过细胞划痕实验观察FTY720对两种细胞迁移能力的影响。通过流式细胞技术使用Annexin V-FITC/PI法分析药物作用前后的细胞凋亡率,使用RNase/PI法检测分析药物作用前后两种细胞的周期进程,研究FTY720对脊索瘤细胞凋亡和细胞周期的影响。再者,通过Western-blot方法和免疫荧光技术分析经FTY720处理的脊索瘤细胞中上皮间质转化(EMT)相关分子E-cadherin和vimentin表达情况的变化,评估药物作用后对两种细胞上皮间质转化进程的影响。进一步,为了研究FTY720抗肿瘤作用的相关机制,使用Western-blot方法检测IL-6/STAT3通路中关键蛋白IL-6、p-STAT3和STAT3的表达情况。进而,两种脊索瘤细胞经FTY720和人重组IL-6共同作用进行回复实验,继续使用MTS实验、Edu实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、流式细胞技术和western-blot方法,检测与FTY720单独作用相比,两种细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、细胞周期及上皮间质转化指标的变化情况,分析IL-6/STAT3信号通路与FTY720抗肿瘤作用之间的关系。在体内实验中,实验动物采用36只6周龄BALB/c雌性免疫缺陷裸鼠,将脊索瘤细胞U-CH1种植于裸鼠皮下,待肿瘤生长到一定大小后于裸鼠尾静脉注射FTY720,继续喂养5周同时每周测量肿瘤的体积大小,最后剥离肿瘤组织后称重,一部分制作脊索瘤组织石蜡切片,另一部分提取瘤体组织蛋白。使用HE染色观察细胞形态学改变确认脊索瘤组织,并使用免疫组织化学染色方法检测裸鼠脊索瘤组织中IL-6,、Ki-67的表达情况,使用Western-blot方法检测裸鼠脊索瘤组织中IL-6、p-STAT3和STAT3的表达情况。采用统计学软件SPSS20.0对所得出的实验数据进行统计分析,实验的数据均以均值±标准差(X±S)表示,组间数据的比较采用t检验,p<0.05被认为有统计学意义,各实验均重复3次。结果:1.MTS实验结果显示在给药浓度范围内,FTY720对两种脊索瘤细胞MUG-Chor1和U-CH1的增殖能力有明显的抑制作用(P<0.001),并且具有明显的时间依赖性和剂量依赖性,而且FTY720对正常人成骨细胞hFOB1.19没有明显的抑制效果,说明在给药浓度范围内FTY720对正常细胞没有明显毒副作用;此外,集落形成实验表明FTY720可以有效减小MUG-Chor1和U-CH1脊索瘤细胞集落的密度和体积;通过Edu成像观察到,经过FTY720处理后,MUG-Chor1和U-CH1细胞DNA复制的活跃度降低,处于DNA复制增殖状态的细胞百分比明显下降;以上结果均表明FTY720可以有效抑制脊索瘤细胞增殖。2.Transwell侵袭实验结果表明,在FTY720处理后MUG-Chor1和U-CH1细胞穿过聚碳酸酯薄膜的细胞数明显少于对照组;细胞划痕实验结果显示,经过FTY720作用后,MUG-Chor1和U-CH1细胞的迁移距离显著减小,表明FTY720抑制了脊索瘤细胞的侵袭和迁移能力。3.通过流式细胞技术使用Annexin V-FITC/PI法分析细胞凋亡率,发现经过FTY720作用后,与DMSO对照组相比,MUG-Chor1和U-CH1细胞的凋亡比例显著升高;通过RNase I/PI染色法检测MUG-Chor1和U-CH1的细胞周期进程,发现在FTY720处理后两种细胞位于G0/G1期的比例显著升高,位于S期的细胞比例显著降低。表明FTY720诱导了细胞凋亡和细胞周期阻滞。4.Western-blot和免疫荧光结果显示,MUG-Chor1和U-CH1经过FTY720作用后,E-cadherin的表达升高,同时vimentin的表达降低,说明FTY720抑制了脊索瘤细胞的上皮间质转化。5.Western-blot结果发现,经过FTY720作用后,IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表达显著降低,说明FTY720抑制了IL-6/STAT3通路的活性。进而,MUG-Chor1和U-CH1给予IL-6和FTY720共同作用,与单独给予FTY720作用相比,结果表明加入IL-6后FTY720抑制脊索瘤细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化能力均明显减弱,同时IL-6也减弱了FTY720促脊索瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞能力,表明IL-6/STAT3信号通路与FTY720抑制细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化,并诱导细胞凋亡和周期阻滞相关。6.在动物实验中,将脊索瘤细胞种植于裸鼠皮下,经过FTY720治疗后的裸鼠与对照组相比,脊索瘤组织的体积和重量均明显减小,免疫组化染色显示IL-6和Ki-67表达降低,并且肿瘤组织中IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白表达发生下降,表明FTY720同样可以抑制裸鼠种植模型中脊索瘤组织的生长,并抑制组织中IL-6/STAT3信号通路活性。结论:1.FTY720有效抑制脊索瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。2.FTY720通过诱导细胞凋亡和G0/G1期细胞周期阻滞抑制脊索瘤细胞增殖。3.FTY720通过抑制脊索瘤细胞上皮间质转化抑制脊索瘤细胞的侵袭和迁移。4.FTY720通过抑制IL-6/STAT3通路活性发挥对脊索瘤细胞的抗肿瘤作用。5.FTY720可抑制裸鼠种植模型中脊索瘤组织的生长。