论文部分内容阅读
KTM3315A是本课题组创制的一种温敏雄性不育小麦系,由于其育性具有生态敏感性,在较低温度条件下(<18℃)表现完全雄性不育,而在较高温度条件下(>20℃时)雄性育性部分恢复,具备一系两用的功能,因此其在两系杂交育种中具有很大的应用空间。目前,虽然已经对其生理、表型及转录组做了相关研究,但是其温敏雄性不育的分子机制仍尚待研究。本研究从不育系KTM3315A及其同型保持系TM3315B的表型及细胞学出发,通过细胞学研究找出败育发生的关键时期及可能的机理,然后利用同位素标记相对与绝对定量技术(iTRAQ)比较分析了小麦雄性不育系KTM3315A及其同型保持系TM3315B三个发育时期中的花药蛋白质,目的是通过对差异蛋白的富集分析找出差异蛋白显著富集的通路,从而确定育性相关的代谢通路及育性候选基因,同时期望能为小麦细胞质雄性不育研究提供新思路。主要研究结果如下:1.通过DAPI染色结果可知,败育发生的高峰期在单核晚期,由半薄、超薄切片结果中不育花药绒毡层在单核早期就开始降解,而可育花药绒毡层在此时还很完整,推测绒毡层的提前降解可能是导致KTM3315A小麦不育的重要原因。2.对两个材料三个时期的6个花药样品进行蛋白质组学测序,通过73,688个谱图匹配到23,277个肽段,最终鉴定了5,570种蛋白质,其中包括1450个差异富集蛋白。每个时期的差异蛋白功能注释和代谢通路富集分析显示,三个时期的差异蛋白均显著富集到碳水化合物代谢及能量代谢通路,说明碳水化合物代谢及能量代谢通路对小麦育性非常重要。进一步对碳水化合物代谢及能量代谢分析发现,差异蛋白富集的主要KEGG通路包括糖酵解途径、柠檬酸循环以及氧化磷酸化途径,通路中许多关键蛋白,如:甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙酮酸激酶和6-磷酸果糖激酶1、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、NADH-脱氢酶、ATP合酶都是显著下调的,说明小麦雄性不育有可能与这些关键通路中关键蛋白的下调有关。3.通过对差异蛋白显著富集的通路之间的关系进行分析,构建了一个导致小麦雄性不育的蛋白潜在调控网络。即调控网络中关键蛋白的下调,直接导致碳水化合物代谢与能量代谢失调,致使小麦育性下降。ATP含量测定结果及可溶性糖含量测定结果在一定程度印证了蛋白调控网络与雄性不育的关系。4.荧光定量PCR结果可知,差异富集蛋白的荧光定量结果与蛋白测序结果一致性较差,说明蛋白质水平与mRNA水平并没有很好的相关性,进一步说明mRNA不是蛋白水平上鉴定蛋白的可靠验证指标。本研究通过对蛋白质组学分析、细胞学观察和生理指标测定,构建了一个可能导致KTM3315A不育的蛋白调控网络,该网络初步揭示其不育的分子机理,同时本实验为雄性不育的研究提供了理论支持。