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荧光成像作为一种直观、原位的可视化观测技术,其在功能分子标记和检测方面已经得到了广泛的应用。其中,基于有机染料的分子荧光探针具有操作简便、重现性好等优点,因此其可被方便地用于生物分子的原位成像、实时无损检测以及生物分子生理变化过程的示踪。然而大多数传统有机荧光染料具有Stokes位移小、耐光漂白能力差以及在含水生物环境中荧光猝灭等缺点,造成生物成像应用时信背比低和严重的荧光自猝灭现象,限制了其在生物体内的进一步应用。另一方面,双光子荧光成像由于更深的组织穿透力（高至1,000μm）和更小的组织吸收,同时可以很好的抑制样品成像过程中的光损伤、光漂白以及自发背景荧光,近年来也被广泛用于生物系统中生物分子的成像和检测。然而,到目前为止,双光子染料的发射波长大多集中在蓝光-黄光区域（420-550 nm）,在此区间生物组织仍然具有非常严重的背景荧光,导致成像检测时信背比不高、检出限偏低。为了更好地使荧光探针满足生物分析实际应用的需求,设计和开发具有性能优良的有机荧光染料/探针对于当前研究是十分有必要的。本论文的研究工作主要基于分析化学、有机化学、材料化学以及生物科学等学科领域的交叉,从荧光分子发光机理和化学结构创新入手,设计合成一系列具有新型功能的小分子染料,为目前荧光染料在构建荧光成像探针中出现的上述瓶颈问题提供新的解决方案。具体研究内容如下:1)针对目前文献中报道的大多数双光子探针发射波长短,在生物组织中仍然具有极强的背景荧光问题。在第二章中,我们通过对天然染料花色素的改造,设计合成了一类具有远红光-近红外发射和大双光子吸收截面积的双光子染料AC-Flour。系统的“构（结构）-效（光谱性能）”关系研究表明,通过特定位取代基的变换,AC-Flour染料的发射光谱和量子产率均可实现精准调控,其发射光谱覆盖整个可见光区域（467-707 nm）。值得注意的是,在水环境体系,染料AC-Flour的双光子截面最高可达1139 GM,适合发展双光子生物成像荧光探针。在此基础上,我们通过简单修饰分别设计合成了线粒体靶向试剂Mito-tag和双光子荧光探针ACF27-Cu2+。实验结果表明Mito-tag和ACF27-Cu2+均能很好应用于生物体成像研究,特别是深层组织的双光子成像研究,表明AC-Flour染料在双光子荧光成像方面具有很大的应用潜力。2)针对传统荧光染料在细胞胞浆水环境中容易发生荧光猝灭现象的问题,在第三章中,受天然荧光染料GFP的启发,通过对传统电子“供体-受体”结构（D-A）染料Acedan进行改造,我们发展了一类利用氢键诱导荧光增强（HIEE）的反溶剂化D-A染料TPC。理论计算表明,TPC染料分子与极性溶剂如水分子形成的氢键可有效抑制分子内的旋转,同时增强分子内的电荷转移,使激发态振子强度增大,发出强荧光。系统的光谱性能研究也表明,通过与极性分子间的氢键作用,染料TPC的荧光可随着测试体系极性的增加而逐渐增强,尤其在水溶液中,TPC染料的量子产率可高达0.80。此外,双光子荧光测试表明,在水环境体系,染料TPC的双光子活性截面最高可达211 GM,适合发展双光子生物成像荧光探针。为了验证TPC染料在生物成像中的优势,我们设计合成了新型双光子H2S探针TPC-N3,并首次成功实现了肝硬化过程中气体信号分子H2S的波动检测。3)针对传统荧光染料小的Stokes位移,导致在当前显微镜配置下差的信噪比和自猝灭的问题,在第四章中,我们开发了一种增大常规荧光染料Stokes位移的通用策略。通过简单地将1,4-二乙基-十氢喹喔啉（DQ）结构单元添加到传统染料的共轭结构上,我们可以轻松地将11种不同荧光团的斯托克斯位移增大到3倍以上,同时延长发射波长和增强其光稳定性。理论计算表明,强供电基团DQ的引入,增强了传统染料在激发态时的振动弛豫,从而使其激发态的非辐射跃迁增多,最终增大了斯托克斯位移并红移传统染料的发射波长。实验结果显示,我们的半花菁衍生物DQF-693在小鼠模型中产生了比吲哚菁绿强5倍的荧光信号,表明这种通用方法可以显著提高传统荧光团的成像效率。此外,DQ修饰的荧光团还可与其母体染料分子配对使用,实现单波长激发的多发射荧光成像,使我们能够更好地研究细胞行为。4)针对目前近红外二区（NIR-II）荧光染料存在的光学性能难调控等问题,在第五章中,我们发展了一类新型NIR-II荧光染料NIRⅡ-CS。实验结果表明NIRⅡ-CS1-2都具有很好的近红外二区发射,且其NIR-II荧光可以通过螺环的“开-关”方便进行控制。此外,光谱测试也表明NIRⅡ-CS染料在水溶液中具有良好的抗荧光猝灭能力,适合发展生物分子响应的近红外二区荧光探针。基于此,我们构建了新型NIRⅡ荧光探针NIRⅡ-CS-pH、NIRⅡ-CS-Hg和NIRⅡ-CS-ATP。光谱测试结果显示这些探针均能对相应的分析物具有很好的荧光响应,表明NIRⅡ-CS系列染料在NIRⅡ荧光成像方面具有很大的应用潜力。