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布氏杆菌病(Brucellosis)是一种重要的人兽共患病,由布氏杆菌(Brucella)感染所致。它的流行范围广,传染性强,感染后根治十分困难。布氏杆菌病严重危害人类健康和畜牧业发展。上世纪90年代以来,我国布氏杆菌病发病率呈现逐渐上升的趋势。由于现有的布氏杆菌疫苗仍然存在诸多缺陷,如保护率低、副作用大、难以区分人工免疫和自然感染。鉴于布氏杆菌疫苗的这些缺点,世界上许多实验室都在积极致力于开发更加安全有效的疫苗。本研究以菌壳这一新型疫苗为基础,制备布氏杆菌菌壳,对其安全性进行评价,并研究其免疫学特性。菌壳(Bacterial ghosts)作为一种新型灭活疫苗,由导入到细菌细胞内的噬菌体PhiX174裂解蛋白E表达后,在细菌表面形成跨膜孔洞,通过跨膜孔道,细菌内容物即可流出细胞,从而使细菌的核酸、核糖体等内含物缺失,形成细菌空壳。这种方法是以非变性方法来灭活细菌,使菌体保持了原始的细胞表面抗原结构。此外,细菌外膜的一些天然结构(如脂多糖、肽聚糖等)使菌壳自身具有内在的佐剂活性。菌壳的制备过程保证了布氏杆菌具有原始的细胞形态和天然表面抗原,能为机体提供良好的免疫原性。并且由于细胞内容物的流失确保了菌壳的安全性。本研究首先将温控调节系统λpL/pR-cI857和噬菌体裂解基因E克隆到穿梭质粒pBBR1MCS-2中,构建出重组温控裂解质粒pBBR1MCS-E;然后将该重组质粒电转化入布氏杆菌S2疫苗株,通过温度变化诱导E基因的表达而制备布氏杆菌菌壳;再对布氏杆菌菌壳的形态、裂解率、安全性和免疫学特性进行了研究。结果表明,裂解质粒对布氏杆菌裂解率可达99.99%,通过高渗溶液冻融后可完全消除其中残存的活菌。菌壳保持细胞的表面抗原结构,但由于细胞内容物外流而使细胞形态发生明显皱缩。小鼠接种布氏杆菌菌壳(BSG)、布氏杆菌甲醛灭活菌(FKB)和布氏杆菌活疫苗(S2)后,S2组小鼠体重大幅下降、精神萎靡、严重耸毛,部分小鼠死亡(5/10),解剖后S2组小鼠脾脏极度肿大,平均脾重为0.406g/只小鼠,与对照组差异显著,而BSG组和FKB组生长正常,脾重正常,与对照组无显著差异,表明布氏杆菌菌壳具有良好的安全性。血清抗体检测结果显示,BSG组和S2组小鼠均可产生较高血清抗体效价,BSG组效价略高于S2组,免疫后6-7周抗体滴度达到最高(约6400),免疫8周后仍可检测到高滴度的抗体。流式细胞仪检测T淋巴细胞亚型结果表明,BSG和S2组小鼠脾淋巴细胞中CD3+和CD4+细胞显著高于阴性对照组和FKB组小鼠,BSG组和S2组的CD4+/CD8+比例也显著高于阴性对照组和FKB组小鼠,说明菌壳可以激活与活疫苗相似的细胞免疫水平。利用小鼠感染模型进行的免疫攻毒实验结果显示,BSG、S2和FKB组的免疫保护率分别为13/20、5/20和2/20,而阴性对照组存活率为0/20。综合本研究结果表明,布氏杆菌菌壳具有良好的安全性和免疫原性,对小鼠感染模型具有较好的免疫保护效果,可以作为预防人或动物布氏杆菌病的新型候选疫苗。本研究为开发布氏杆菌这一胞内寄生菌的新型菌壳疫苗奠定了基础,也为其它胞内寄生病原菌的疫苗开发提供了新的思路和方法。