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树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是一种具有强大抗原提呈功能的免疫细胞,可促进T细胞和B细胞增殖分化,能够启动适应性免疫应答,具有调节炎症性免疫反应和免疫耐受的作用。DCs可以通过与肠道中的益生菌如乳酸杆菌作用调节机体黏膜免疫反应。约氏乳酸杆菌(Lactobacillus johnsonii,L.johnsonii)作为肠道中的益生菌能够调节宿主免疫反应,在维持宿主肠道内环境稳态、调节肠道内共生菌群的平衡和保持机体健康方面发挥着重要作用。分离于仔猪体内的约氏乳酸杆菌常被用于饲料添加剂,具有维持肠道菌群平衡,刺激黏膜免疫系统发育,促进营养吸收提高造血功能的益生作用;由于其安全性和可靠性,还可作为口服疫苗中递送抗原的理想传送载体。因此研究约氏乳酸杆菌对树突状细胞免疫功能的影响,对揭示乳酸菌对肠道黏膜免疫激活作用的机制具有重要意义。本实验通过采集5-8周龄仔猪外周血,利用Histopaque-1077淋巴细胞分离液分离出外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs),再加入猪CD172a-PE单克隆抗体对单核细胞进行标记,用抗PE磁珠进行筛选,分离出了单核细胞,分别加入终浓度为20ng/mL的重组蛋白pGM-CSF和pIL-4诱导培养,其间每两天半量换液,经过6d的诱导培养,获得未成熟的单核源树突状细胞(Monocyte derived dendritic cells,MoDCs),经流式细胞术检测纯度为90%以上。为明确约氏乳酸杆菌对猪MoDCs的激活作用,本实验采用约氏乳酸杆菌热灭活菌体(Heat-killed L.johnsonii,HK L.johnsonii)、约氏乳酸杆菌无细胞上清液(L.johnsonii Cell-Free Supernatant,L.johnsonii-CFS)和具有活性的约氏乳酸杆菌菌体(Live L.johnsonii)分别与树突状细胞作用,分析其对MoDCs免疫功能的影响。为探究约氏乳酸杆菌作为活菌口服疫苗载体对树突状细胞的激活特性,本研究构建了表达PEDV保护性抗原ps420蛋白的重组约氏乳酸杆菌pPG-T7g10-PPT-ps420/L.johnsonii,经过western blot鉴定,表明重组约氏乳酸杆菌表达了约59KDa的ps420蛋白。为获得ps420纯蛋白,构建了表达PEDV ps420蛋白的重组大肠杆菌pET-28a-ps420/BL21。经过SDS-PAGE和Western blot鉴定,纯化出了约17KDa的ps420蛋白。分别用HK L.johnsonii、L.johnsonii-CFS和Live L.johnsonii刺激诱导培养6d的MoDCs 12h,流式细胞术分析,发现HK L.johnsonii和L.johnsonii-CFS对MoDCs表面分子CD172a、MHCII类分子和CD80上调不显著,而Live L.johnsonii可以显著的促进MoDCs表面分子表达量上调。qRT-PCR检测MoDCs表达Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)分子、细胞因子和趋化因子mRNA水平,结果发现HK L.johnsonii除了使IL-1β和IL-10 mRNA水平有微弱上调外,没有明显的刺激MoDCs其他相关TLRs、细胞因子和趋化因子mRNA水平的上调,L.johnsonii-CFS只能够较明显的刺激MoDCs中抑炎性细胞因子IL-10 mRNA水平上调,而TLRs、促炎性细胞因子和趋化因子则没有上调。Live L.johnsonii既能使TLR2、TLR4、TLR6、促炎性细胞因子IL-1β、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ和趋化因子CCL20表达量上升,又能够促进抑炎性细胞因子IL-10上调。以未刺激的MoDCs作为对照组,经HK L.johnsonii、L.johnsonii-CFS和Live L.johnsonii作用的MoDCs作为刺激细胞,CD4~+T细胞为反应细胞,按刺激细胞:反应细胞为1:10比例进行混合培养,采用CCK-8试剂盒检测MoDCs刺激CD4~+T细胞的增殖能力,结果发现HK L.johnsonii依然没有调节T细胞增殖的能力,L.johnsonii-CFS组也没有显著的促进CD4~+T细胞增殖,但在MoDCs与CD4~+T细胞共培养的体系中采用ELISA方法检测到了IL-10细胞因子的产生。Live L.johnsonii组能够诱导CD4~+T细胞增殖,在CD4~+T细胞与MoDCs共培养的体系中发现既有抑炎性细胞因子IL-10的产生又有促炎性细胞因子IL-12p40的存在,二者处于平衡状态。分别用pPG-T7g10-PPT-ps420/L.johnsonii和ps420蛋白刺激MoDCs,结果发现二者均能够引起MoDCs表面分子CD172a、CD80、MHCII类分子上调。qRT-PCR分析发现MoDCs中细胞因子IL-1β、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ、Toll样受体TLR2、TLR6,趋化因子CCL20 mRNA含量增加,TLR4含量没有显著增加,而抑炎性细胞因子IL-10 mRNA水平相比于Th1型细胞因子有关的促炎性细胞因子IL-1β、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ增加不明显。CD4~+T细胞增殖实验结果显示pPG-T7g10-PPT-ps420/L.johnsonii和ps420蛋白均能引起CD4~+T细胞增殖,MoDCs与CD4~+T细胞共培养的体系中主要产生Th1型细胞因子IL-12p40。通过扫描电子显微镜观察,pPG-T7g10-PPT-ps420/L.johnsonii能够刺激MoDCs发挥摄取吞噬抗原功能。以上研究结果表明,构建的重组约氏乳酸杆菌能够刺激MoDCs成熟活化,促进了MoDCs促炎性细胞因子的分泌,并引起了CD4~+T细胞的增殖,经pPG-T7g10-PPT-ps420/L.johnsonii刺激的MoDCs能够介导CD4~+T细胞向Th1型细胞分化。具有活性的约氏乳酸杆菌在一定程度上能够调节MoDCs发挥免疫激活作用,引起CD4~+T细胞增殖,但比pPG-T7g10-PPT-ps420/L.johnsonii程度低,同时Live L.johnsonii还能够促进抑炎性细胞因子IL-10的分泌,总体趋向于调节机体免疫平衡。L.johnsonii-CFS只能够刺激MoDCs产生IL-10,对细胞表面分子和CD4~+T细胞增殖的影响较小,因此可能具有调节MoDCs免疫耐受的功能。而HK L.johnsonii几乎不具有对MoDCs产生免疫调节作用,说明约氏乳酸杆菌的免疫调节能力与其活性有关。