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本文采用RAPD标记和ISSR标记技术对收集到的66份品种资源进行了遗传多样性研究,以期从分子水平揭示它们之间的亲缘关系,为柞蚕遗传资源的鉴定及品种资源的发掘、利用提供分子水平的依据。结果如下:
1.通过优化、筛选建立了适合柞蚕基因组的ISSR反应体系及反应程序。优化后的PCR程序为:94℃预变性5min,94℃变性60s,退火温度因引物不同而异,时间为90s,72℃延伸2min,36个循环,最后72℃延伸10min。并且还发现,不同引物的退火温度应在计算引物Tm值的基础上,再略微升高l~2℃,会得到较为理想的扩增结果。
2.从30个ISSR引物中筛选出11个多态性好的引物进行PCR分析,11个ISSR引物扩增的DNA条带数分别在6~14条之间,共扩增出清晰、稳定性好的多态性条带118条,平均每个引物扩增带数为10.72条,分子量从100~2000bp,多态性条带比率(Percentage of:Polymorphism Bands,PPB)为90.67%。其中扩增条带数最多的是引物ISSR02,共扩增出14条带,其中11条有多态性。扩增条带数最少的为引物ISSR05,只扩增出6条带,仅有2条有多态性。在供试的66个柞蚕品种中,有2个品种扩增出品种特有带,分别是741和特大1号。
从30个RAPD引物中筛选出11个多态性好的引物进行PCR扩增分析,11个RAPD引物扩增的DNA条带数分别在10~14条之间,共扩增出清晰、稳定性好的多态性条带124条,平均每个引物扩增带数为11.27条,分子量从100~2000bp,PPB为87.09%。其中扩增条带数最多的是引物RAPD01,共扩增出14条带,其中12条有多态性。
3.比较利用ISSR标记与RAPD标记得到的66份供试材料之间的遗传相似性系数,发现两种标记检测出的遗传相似性系数虽然大小不尽相同,但是总的趋势大体相似。用RAPD方法标记的66份供试材料的遗传相似性系数范围在0.456~0.831,遗传相似性系数平均为0.663。而用ISSR方法标记得到遗传相似性系数范围在0.390~0.805,遗传相似性系数平均数为0.660。从以上结果可知,ISSR标记的遗传相似性系数值得范围比RAPD标记稍大,而平均遗传相似性系数略小于RAPD。表明供试柞蚕品种或品系之间的遗传差异较小。
4.采用RAPD标记方法将66个柞蚕品种或品系分为了5大类群,ISSR标记方法将66个柞蚕品种或品系分成了4大类群。而且采用两种标记的分析结果利用NTSYSpcVersion2.1软件构建的66个品种或品系聚类图中,供试的柞蚕品种并没有完全按体色或化性聚在一起。在基于RAPD方法的聚类图中,地理位置相近的我国辽宁省、吉林省、内蒙古自治区及朝鲜等的大部分品种聚为相对集中的一类。在基于ISSR方法的聚类图中,除了地理位置上较接近的辽宁省、黑龙江省、内蒙古自治区及朝鲜的品种聚为较集中的一类外,同时还发现,来源于吉林省、河南省的品种均各自聚为一类。所以从来源、体色与种问的聚类关系上来看,柞蚕品种间的亲缘关系与5龄幼虫的体色及化性相关性不大,而与产地有密切的关系。