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核酸疫苗是指将含有编码蛋白基因序列的质粒载体导入宿主体内,通过宿主细胞表达相应的抗原蛋白,诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答。直接将核酸疫苗注射到宿主体内,易过早被体内的核酸酶降解,而不能有效发挥作用。因此,核酸疫苗免疫治疗成功的关键是发展出一种具有靶向特异性与基因高效转移和缓慢表达,并且不产生任何毒副作用的理想佐剂,但现行佐剂存在安全性低、稳定性不强以及局部毒副作用等问题。纳米金(Gold nanoparticles,GNPs)是粒径在10-150 nm间的胶体金颗粒,制备简单,价格低廉,具有高电子密度,能与DNA、蛋白质等多种生物大分子结合,降低大分子在体内的半衰期,且不影响其生物活性,生物相容性好。提示纳米金可能作为一种新型的核酸疫苗佐剂。哺乳动物中枢神经系统(Central nervous system,CNS)损伤后再生困难的一个重要原因是中枢微环境存在髓磷脂抑制因子(myelin-associated inhibitors,MAIs),现发现四种MAIs:Nogo-A、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)、髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和硫酸软骨素蛋白多醣(chondroition sulfate proteoglycans,CSPGs),它们主要通过Nogo受体(Nogo-66 receptor,NgR)和配对免疫球蛋白样受体 B(paired immunoglobulin-like receptor B,PirB)介导对神经再生的抑制作用。因此,以NgR、PirB为双靶点采取干预措施可能会逆转MAls介导的神经再生抑制作用。为探讨GNPs作为核酸疫苗佐剂的可行性,本研究以MAls信号为切入点,将GNPs与GMCSF-NgR-PirB双靶向核酸疫苗以不同体积比混合后免疫动物,通过疫苗接种后对血清抗体滴度检测探讨GNPs作为核酸疫苗佐剂的可行性,并比较得到质粒与GNPs结合的最佳体积比。体外观察抗血清对神经元突起生长的影响,结合行为学检测、凋亡分析、束路追踪及病理染色等技术在体内观察其对损伤脊髓轴突再生及功能恢复的影响,并利用免疫荧光和Western blot技术进行相关分子机制研究,为脊髓及其他中枢神经系统损伤修复提供新的方法,为核酸疫苗佐剂研究提供新的方向。主要研究内容:1、纳米金对核酸疫苗免疫原性的影响及最佳制剂的获得粒径为15 nm纳米金的制备与鉴定,pcDNA-GMCSF-NgR-PirB质粒的扩增、鉴定及体外表达检测,pcDNA-GMCSF-NgR-PirB经GNPs不同体积比包被后免疫动物、抗体滴度检测获得最佳制剂,形成高效价的双靶向融合核酸疫苗。2、纳米金介导的GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗对损伤脊髓的免疫治疗作用将纳米金和脂质体与质粒以最佳制剂比混合后免疫动物,连续免疫六周后进行脊髓损伤(spinal cord injury,SCI))半切造模。行为学采用BBB评分和Catwalk步态分析评估各组大鼠后肢功能恢复情况;组织水平通过神经示踪检测疫苗免疫对脊髓神经束信号传递功能恢复的促进作用,通过HE、Nissl及TUNEL组织病理学染色检测脊髓损伤处神经元的数量、形态、分布及神经元的凋亡情况,观察疫苗免疫对SCI大鼠脊髓神经元的保护作用;免疫荧光染色及Western blot检测损伤处脊髓NgR、PirB及下游分子RhoA和ROCK2,以及神经生长因子GAP-43和突触可塑性相关蛋白Synapsin I的表达情况,从分子水平探讨疫苗免疫对SCI大鼠行为学改善的作用机制。3、体外检测抗血清对神经元突起生长的影响体外以PC12细胞为神经元培养模型,以MAG模拟体内的神经生长抑制作用,探讨抗血清对神经元突起生长的影响,并通过免疫荧光和WB检测相关蛋白表达情况,探讨其作用机制。主要结果及结论:1.ELISA结果显示GNPs和脂质体分别与质粒以1:1体积比混合免疫动物效果最佳。2.以GNPs为佐剂能有效促进双靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗进入动物体内,刺激机体免疫系统产生特异性抗体,中和损伤脊髓的NgR和PirB蛋白,逆转其介导的髓磷脂再生抑制信号的传递,促进受损脊髓神经纤维修复及运动功能改善。3.以GNPs为佐剂明显提高了核酸疫苗的免疫效果,且其作为佐剂,免疫效应与阳性对照佐剂脂质体效果相当。