肾脏是调节水盐代谢的重要器官,具有多种内分泌功能。肾素-血管紧张素系统(RAS)作为一个调节血压、维持水电解质平衡的整体,它的过度激活在高血压及相关疾病的发生发展过程中起着关键的作用。经典的RAS是指循环的RAS,而目前的研究表明,除了经典的RAS外,在肾脏还存在着局部组织的RAS。肾内的RAS不但可以调节肾脏血管活性,保持水盐代谢平衡,还可以调控组织生长。RAS系统的正常活性对肾脏的发育至关重要,孕期母体应用血管紧张素受体抑制剂或血管紧张素转化酶抑制剂会导致胚胎发育异常,引起成年后肾功能下降。血管紧张素Ⅱ(Ang II)是肾素-血管紧张素系统的主要效应因子,除了收缩血管和调节水电解质平衡外,还参与了炎症反应的重要过程,在高血压的形成和靶器官的损伤中起着重要的作用。因此,任何原因如果改变了肾内RAS的活性,则引起肾脏的病理生理改变,导致肾脏损害和高血压的发生。目前的研究表明,炎症和高血压有很大的相关性,高血压患者血浆中促炎细胞因子如TNF-α、IL-6明显增高。LPS是革兰氏阴性杆菌细胞壁的脂多糖,常作为非特异性炎症免疫刺激剂模拟细菌炎症反应。LPS和它的特异性受体TLR4结合后启动一系列的磷酸化反应,促使核转录因子NF-κB从胞浆转移到胞核,诱导TNF-α、IL-1β和IL-6的转录和释放,最终导致炎症反应。Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC)是合成的抗氧化剂,通过阻止IκB的降解和NF-κB向核内的转移抑制NF-κB活性,被认为是强有力的NF-κB抑制剂。酵母多糖是单细胞真菌酵母菌细胞壁的成分,主要由β-葡聚糖和甘露聚糖组成。酵母多糖是TLR2/6受体的特异性配体,它能激活单核细胞、巨噬细胞和淋巴细胞,刺激炎症介质的释放,包括TNF-α、IL-8和过氧化氢,引起全身性的炎症反应。我们研究室以往的研究显示,孕期第8、10、12天母体应用脂多糖(LPS)或酵母多糖(Zymosan)刺激引起子代成年大鼠发生高血压,但其机制目前尚不清楚。由于孕期第8、10、12天正值肾脏早期发育的关键时间窗,我们设想,孕期炎症刺激可能影响了子代大鼠肾脏的发育,导致肾脏结构和功能异常而引起了高血压。本研究应用LPS或Zymosan两种分别来自细菌和真菌的免疫刺激剂探讨孕期炎症免疫刺激对子代大鼠肾脏结构和功能的影响及其初步机制,旨在为高血压的预防和治疗提供新思路。方法在孕期暴露于LPS的模型中,孕鼠(SD大鼠)被随机分成四个组(每组8只):对照组、LPS组、PDTC组和LPS+PDTC组。其中LPS组动物于孕第8、10、12天给予腹腔注射LPS 0.79mg/kg,LPS+PDTC组动物在给予LPS的基础上,在孕第8~14天每天给予腹腔注射PDTC 100 mg/kg。对照组和PDTC组大鼠分别于相应时间给予生理盐水或PDTC。在孕期暴露于Zymosan的模型中,孕鼠被随机分为2组,每组6只。对照组:在孕第8、10、12天每天给予腹腔注射生理盐水0.5ml。Zymosan组:在孕第8、10、12天每天给予腹腔注射Zymosan 2.37mg/kg。1.为评价子鼠肾脏发育情况,在子鼠7周龄时采用酸浸渍法测定单肾肾小球数量。2.为了评估子鼠肾功能,在子鼠7、16和25周龄时测定肌酐清除率和尿蛋白水平。血肌酐和尿肌酐的测定采用多通道动态分光光度法,尿蛋白测定用连续注射分光光度法。3. Real-time PCR测1日龄和7、16、25周龄大鼠肾皮质肾素和血管紧张素转化酶的mRNA表达。4.用免疫组织化学染色或TUNEL染色测大鼠肾脏Ang II-阳性细胞、单核-巨噬细胞、淋巴细胞、Ⅰ型胶原和TUNEL核阳性细胞的表达。5.用放射性免疫测定方法测7、16、25周龄子鼠血浆肾素活性和Ang II水平。6. Western blot测1日龄和7、16、25周龄大鼠肾皮质AT1-R的蛋白表达。7.凝胶电泳迁移率实验测25周龄大鼠肾皮质NF-κB的活性。8.基因芯片分析胚胎Angiotensinogen、Renin、AT1-R和AT2-R的表达并对变化基因进行Real-time PCR验证。9.子鼠动脉血压从7周龄开始测,每3个月测量一次,一直测到25周龄。血压的测定采用标准尾套法大鼠尾动脉血压测定方法。结果1.孕期暴露于LPS引起子代大鼠肾小球数量明显降低,PDTC能够有效逆转LPS引起的肾小球数量的降低。2.孕期暴露于LPS引起7、16、25周龄子代大鼠肌酐清除率明显降低而尿蛋白水平明显增高。PDTC能够完全逆转LPS引起的肌酐清除率降低和尿蛋白的增高。3.孕期暴露于LPS降低子代新生大鼠肾皮质肾素mRNA的表达而增加7、16、25周龄大鼠肾皮质肾素mRNA的表达。PDTC能有效抑制孕期LPS引起的肾素mRNA表达的变化。4.孕期暴露于LPS增加25周龄子代大鼠ACE mRNA的表达。新生鼠和7、16周龄子鼠ACE mRNA的表达各组相比无统计学意义。5.孕期暴露于LPS引起新生子鼠肾皮质Ang II-阳性细胞明显降低,而7、16、25周龄子鼠肾皮质Ang II-阳性细胞明显增加。PDTC能有效逆转这些变化。6.孕期暴露于LPS对子代成年大鼠血浆肾素活性和血管紧张素II水平无影响。7.肾皮质AT1-R蛋白表达和肾素mRNA表达呈负相关。LPS处理组大鼠新生子鼠AT1-R蛋白表达增高,而7、16、25周龄子鼠AT1-R蛋白表达降低。PDTC能有效逆转这些变化。8.孕期暴露于LPS引起子代大鼠肾皮质NF-κB活性增高。9.孕期暴露于Zymosan引起子代大鼠肾小球数量减少、肾功能下降。10.孕期暴露于Zymosan引起7、16、25周龄子代大鼠肾皮质肾素mRNA表达增高、肾脏Ang II-阳性细胞增多,对血浆肾素活性和血管紧张素II水平无影响。11.孕期暴露于LPS显著下调胚胎AT2-R受体的表达而上调胚胎炎症因子IL-6和TNF-α的表达,并增加子代成年大鼠肾脏单核巨噬细胞浸润、TUNEL核阳性细胞及Ⅰ型胶原的表达。结论1.孕期炎症免疫刺激引起子代大鼠肾脏发育异常和肾功能损害;2.胚胎AT2-R表达下调、新生子鼠Ang II表达降低、凋亡增加和炎症是孕期炎症免疫刺激引起子代大鼠肾脏发育异常和功能损害的重要原因;3.以肾内肾素-血管紧张素系统活性改变为标志的肾脏发育异常和功能损害是孕期炎症免疫刺激导致子代大鼠高血压的重要原因之一;4. NF-κB参与了孕期炎症免疫刺激引起的子代大鼠高血压和肾损害的发生和发展。