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葡萄膜炎（uveitis）是临床上常见的致盲性眼病之一，常导致眼组织的严重破坏以致视功能的显著下降或丧失。在葡萄膜炎的发病机制中，自身免疫反应一直被认为起着重要的作用。因而，从自身免疫的角度阐明葡萄膜炎的发病机制，寻找新的治疗方案是迫切需要的。实验性自身免疫性葡萄膜炎（Experimental Autoimmune Uveitis, EAU）作为一种常用的葡萄膜炎动物模型,其临床特点与病理特征与人类葡萄膜炎有许多类似之处。EAU主要影响眼后段，是代表人类一些自身反应性葡萄膜炎的常用动物模型。EAU主要是由CD4+T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，最近的研究表明Th1和Th17细胞可能共同参与免疫应答过程，参与了EAU发病过程。进一步研究发现，Th17细胞可以在IFN-γ基因缺陷小鼠中诱发葡萄膜炎，表明Th17细胞具有单独诱导EAU的能力，因而Th17细胞与EAU的发生有着密切联系。 来氟米特（leflunomide，LEF）是人工合成的异唑衍生物类抗炎及免疫抑制剂，临床上应用于器官移植、关节炎和狼疮性肾炎等疾病，具有免疫调节、抗炎、抗增生和免疫抑制的作用。口服后在体内转化为活性代谢物 A771726而发挥作用， A771726在淋巴细胞增生活化、免疫应答的抗原感应识别等多个环节发生抑制作用,具有多种免疫抑制作用,被认为是一种极具潜力的免疫抑制剂。有研究报道来氟米特与糖皮质激素和其他免疫抑制剂联合应用治疗慢性非肉芽肿性葡萄膜炎，但来氟米特直接应用于临床葡萄膜的治疗尚不多见。 本课题通过建立大鼠光感受器间维生素 A类结合蛋白诱导的自身免疫性葡萄膜炎动物模型，评价口服来氟米特对EAU的临床表现和组织学改变的作用，应用免疫组织化学染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、RT-PCR、Western免疫印迹、流式细胞术检测相关炎症细胞相关因子 IL-17、IFN-γ的表达及其意义。A771726是来氟米特的活性代谢产物，EAU模型体外培养体系中，诱导EAU大鼠CD4+T细胞向Th17分化，并加入不同浓度A771726干预，流式细胞仪与酶联免疫吸附试验检测Th17细胞的分化及细胞因子的水平，RT-PCR检测Th17相关基因表达变化，分析A771726对EAU大鼠体外诱导的Th17细胞分化调节的分子机制。为研究葡萄膜炎的发病机制和治疗提供新的理论依据。 本课题的研究主要分为以下两个部分 1．探讨来氟米特体内对实验性自身免疫性葡萄膜炎的保护作用 采用光感受器间维生素 A类结合蛋白（IRBP）与完全弗氏佐剂充分乳化后于Lewis大鼠左足底皮下注射，同时经腹腔注射百日咳毒素(Pertussistoxin，PTX)400ng增强免疫。以建立EAU模型，随机分为正常组、模型组、来氟米特给药组（3mg/kg;6mg/kg;12mg/kg）、环孢霉素阳性对照组（10 mg/kg），每组6-8只。于造模第二天开始灌胃给药，每日1次，灌胃13天。裂隙灯显微镜观察大鼠EAU的症状，造模后第14天制备大鼠眼球切片，以苏木精-伊红染色法进行组织病理学观察，参照Caspi的标准对EAU各组大鼠进行临床症状和病理学分级进行评分，免疫组织化学染色法检测IL-17多克隆抗体在各组大鼠眼组织中的表达，应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中IL-17、IFN-γ和IL-6含量，使用流式细胞仪检测各组大鼠血和脾脏 CD4+Th17细胞亚群纯度，使用 RT-PCR检测各组大鼠眼组织IL-17mRNA、IFN-γmRNA、STAT3mRNA表达水平，Western Blot技术检测EAU大鼠眼组织中p-STAT3的相对含量。造模后8-9天模型组大鼠EAU开始出现炎症，在第14天时炎症达到高峰期，随后炎症迅速消退。Lewis大鼠成功诱发出EAU疾病模型，患病率高达100％，且临床表现及组织学特征稳定。在来氟米特给药组的大鼠中，14天时EAU发病的临床评分均低于模型组，病理学检查显示各给药组大鼠眼组织病变程度明显较模型组减轻。免疫组化显示模型组虹膜、睫状体和视网膜部位可见IL-17蛋白表达，来氟米特各剂量组眼部IL-17蛋白表达明显减少。来氟米特用药组中大鼠血清中IL-17、IFN-γ和IL-6含量均明显低于模型组。流式细胞检测发现，与正常组相比，模型组大鼠血和脾脏Th17细胞亚群比例显著升高，而给予来氟米特后可显著抑制EAU大鼠血和脾脏Th17细胞亚群的分化增殖，且呈剂量依赖性，各组间差异有显著性。RT-PCR检测结果发现来氟米特可明显降低EAU大鼠眼组织中IL-17mRNA、IFN-γmRNA、STAT3mRNA表达水平。Western Blot结果显示，EAU大鼠发病高峰时，眼组织p-STAT3表达增加，而来氟米特用药组抑制p-STAT3表达。在EAU发展中，IL-17作为Th17细胞分泌的特异性因子，参与EAU的发病过程并起到重要作用。EAU发病过程中存在STAT3通路的激活。口服来氟米特能有效抑制EAU大鼠的眼部病情，抑制EAU眼组织中IL-17、IFN-γ等炎性因子和p-STAT3表达，抑制大鼠血清中炎性因子的表达而对EAU起保护作用。 2. A771726在体外对EAU大鼠Th17细胞分化增殖的影响及其机制探讨 制作EAU模型，提取大鼠致敏14d的脾细胞CD4+T细胞，置于含有IRBP抗原的细胞培养板中，使用转化生长因子β（TGF-β）和白细胞介素（IL-6、IL-23）等细胞因子进行诱导，促使其向Th17细胞方向分化，将体外培养的Th17细胞分为6组，分别用不同剂量的A771726（0.1、1、10μM）和STAT3特异性抑制剂S31-201，培养72小时，收集细胞与上清液，通过流式细胞仪与酶联免疫吸附试验检测Th17细胞的分化及细胞因子的水平，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测各组IL-17mRNA、ROR-rtmRNA、STAT3mRNA相对表达量，Western-blot检测培养细胞中磷酸化的信号转导和转录激活因子（P-STAT3）蛋白的表达。A771726可抑制EAU大鼠Th17细胞分化增殖，细胞培养上清液中用药组IL-17的浓度降低，流式细胞仪检测各用药组中Th17细胞的分化增殖明显减少，各组 IL-17mRNA、ROR-rtmRNA、STAT3mRNA的表达量降低，P-STAT3蛋白的表达下降，且呈剂量依赖性。研究发现在EAU大鼠抗原特异性Th17细胞的分化后，TGF-β单独或联合IL-6刺激不能促进Th17细胞进一步分化，TGF-β、IL-6和IL-23可诱导或促进Th17细胞的分化。大鼠EAU发病过程中存在STAT3通路的激活，STAT3信号通路介导了EAU大鼠Th17细胞的分化、增殖。A771726抑制抗原特异性Th17细胞分化增殖，其机制可能与抑制IL-17/STAT3信号通路有关。