中药注射剂是几千年来中药剂型的创新,在治疗急危重症方面具有特色和优势。为全面提高中药注射剂的安全性、有效性和质量可控性,国家食品药品监督管理总局组织开展了多项中药注射剂安全性和有效性再评价工作。丹红注射液由丹参和红花两味中药组成,主要功效为活血化瘀、通脉舒络,临床广泛用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、脑血栓等疾病。丹红注射液是中药注射剂大品种,具有良好的临床安全性和有效性,但是丹红注射液临床联合用药情况较为复杂,复杂的联合用药伴随着未知的药物相互作用,未知的药物相互作用会产生未知的效益或者风险,给丹红注射液的临床安全有效用药带来挑战。本论文在国家科技重大专项课题"符合中药特点的安全用药风险评控关键技术"与步长制药集团重大科研项目"丹红注射液临床联合用药不良反应及其配伍禁忌研究"的支持下,基于丹红注射液与阿司匹林临床高频次联用的临床应用实际,选择丹红注射液与阿司匹林作为代表性联合用药组合,从药动学相互作用和药效学相互作用等不同角度,系统评价丹红注射液与阿司匹林药物相互作用的作用特征及作用机制,综合分析丹红注射液与阿司匹林药物相互作用的效益与风险,为丹红注射液与阿司匹林临床联合用药提供科研基础,为后期构建丹红注射液安全风险调控体系提供数据支撑,为中药注射剂药物相互作用评价及安全风险早期控制提供示范性研究。一、文献研究本章系统归纳了活血化瘀类中药注射剂的临床常用联合用药类型及规律,并基于临床数据和药物组成多角度分析了丹红注射液的临床联合用药规律,发现丹红注射液与阿司匹林是临床联合用药频率最高的药物组合,为设计药物相互作用方案,建立药物相互作用评价体系,发现药物相互作用特征提供基础。二、基于药动学的丹红注射液与阿司匹林相互作用特征与机制与研究药动学相互作用是药物安全性评价的重要部分,其中药物代谢和药物排泄过程是药动学相互作用的研究重点。本章基于药物代谢和药物排泄过程,建立丹红注射液与阿司匹林药动学相互作用评价体系,研究丹红注射液与阿司匹林药动学相互作用特征及作用机制。结果发现,丹红注射液能显著增加阿司匹林体内主要代谢产物水杨酸的血药浓度,但是阿司匹林对丹红注射液中主要酚酸类成分的体内代谢过程无显著影响。丹红注射液与阿司匹林联合用药过程中水杨酸血药浓度增加与丹红注射液抑制肾脏有机阴离子转运体OAT的基因表达和转运功能,减少水杨酸肾小管分泌,导致水杨酸尿液排泄减少有关,与阿司匹林酯酶活性介导的阿司匹林代谢过程以及尿液pH介导的水杨酸肾小管重吸收过程无关。此外,血液循环中增加的水杨酸会通过转化为其他代谢产物(龙胆酸、O-羟基马尿酸、水杨酸葡萄糖醛酸苷和O-羟基马尿酸葡萄糖醛酸苷)进行代偿性排泄。(一)丹红注射液与阿司匹林联合用药对药物动力学过程的影响1.单次联合用药对药物动力学过程的影响为了评价丹红注射液与阿司匹林联合用药对药物动力学过程的影响,建立了能同时测定血浆样品中水杨酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹参素含量的UHPLC-MS/MS方法。结果显示,单次联合用药导致水杨酸血药浓度显著增加(阿司匹林单用 Cmax=39.57μg/ml;联合用药 Cmax=50.33μg/ml;P<0.05);对丹红注射液中主要酚酸类成分的体内代谢动力学过程无显著影响。2.多次联合用药对药物动力学过程的影响采用建立的能同时测定血浆样品中水杨酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸和丹参素含量的UHPLC-MS/MS方法,进一步评价丹红注射液与阿司匹林联合用药14天对药物动力学的影响。结果显示,多次联合用药对药物动力学过程的影响与单次联合用药相同,表现为多次联合用药导致水杨酸血药浓度显著增加(阿司匹林单用 Cmax=16.33μg/ml;联合用药Cmax=38.79μg/ml;P<0.01);对丹红注射液中主要酚酸类成分的体内代谢动力学过程无显著影响。3.基于水杨酸血药浓度增加的丹红注射液与阿司匹林联合用药效益/风险分析丹红注射液与阿司匹林联合用药导致水杨酸血药浓度显著增加,血液循环中增加的水杨酸会浓度依赖性地拮抗阿司匹林的抗血小板作用(风险信号)。同时,水杨酸血药浓度增加将导致水杨酸发生一般不良反应、心脏不良反应或肝脏不良反应的概率增加(风险信号)。此外,水杨酸通过抑制NF-κB活化发挥抗炎作用,联合用药过程中水杨酸血药浓度增加,可能会导致水杨酸对类风湿性关节炎等炎症疾病的治疗作用增强(效益信号)。综上所述,在丹红注射液与阿司匹林联合用药过程中必须根据患者的实际情况,进行系统全面的效益/风险评价,权衡利弊判断联合用药效益是否超过了联合用药风险,实现丹红注射液与阿司匹林联合用药的效益最大化。(二)基于药物代谢的丹红注射液与阿司匹林相互作用研究1.联合用药对阿司匹林酯酶体内活性的影响为了分析丹红注射液与阿司匹林联合用药增加水杨酸血药浓度的可能途径"联合用药导致阿司匹林水解为水杨酸的速率加快,水杨酸血药浓度增加",建立了评价阿司匹林酯酶活性的反应体系和分析方法。结果显示,丹红注射液单次用药或者多次用药后均会显著抑制阿司匹林酯酶活性(P<0.05)。丹红注射液单次用药时对阿司匹林酯酶活性的抑制作用与丹红注射液的血药浓度相关,丹红注射液的血药浓度越高,对阿司匹林酯酶活性的抑制程度越大。2.联合用药对阿司匹林酯酶体外活性的影响为了进一步验证丹红注射液对阿司匹林酯酶活性的抑制作用,建立了体外评价阿司匹林酯酶活性的方法。结果显示,丹红注射液浓度依赖性地抑制阿司匹林酯酶活性(P<0.05),其中丹红注射液对肝微粒体阿司匹林酯酶的抑制作用要强于对血浆阿司匹林酯酶。3.基于阿司匹林酯酶活性的丹红注射液与阿司匹林联合用药效益/风险分析丹红注射液与阿司匹林联合用药显著抑制阿司匹林酯酶活性,提示阿司匹林酯酶不是联合用药导致水杨酸血药浓度增加的作用位点。此外,丹红注射液抑制阿司匹林酯酶活性,将导致阿司匹林水解为水杨酸的速率减慢,阿司匹林的抗血小板作用增强(效益信号)。(三)基于药物排泄的丹红注射液与阿司匹林相互作用研究1.联合用药对阿司匹林主要代谢产物水杨酸尿液排泄的影响为了分析丹红注射液与阿司匹林联合用药增加水杨酸血药浓度的可能途径"联合用药导致水杨酸尿液排泄减少,水杨酸血药浓度增加",建立了测定尿液样品中水杨酸含量的UHPLC-MS/MS方法。结果显示,联合用药会导致水杨酸的尿液排泄量显著减少(P<0.05),特别是对水杨酸排泄高峰期(阿司匹林给药后0-5 h)的影响最大,水杨酸的尿液排泄量从阿司匹林单用时的2.43 ±0.49 mg下降到了 1.35±0.20mg(P<0.001)。结果提示,丹红注射液与阿司匹林联合用药过程中水杨酸尿液排泄量减少可能是联合用药导致水杨酸血药浓度增加的作用途径之一。2.联合用药对水杨酸肾小管重吸收的影响为了分析丹红注射液与阿司匹林联合用药减少水杨酸尿液排泄的可能途径"联合用药导致水杨酸肾小管重吸收增加,水杨酸尿液排泄减少",测定了联合用药对大鼠尿液pH值的影响,并计算了不同pH值尿液样品中分子型水杨酸的分布系数。结果显示,联合用药导致尿液pH值下降0.08,但是这下降的0.08不足以干扰水杨酸的肾小管重吸收。结果提示,水杨酸肾小管重吸收可能不是联合用药减少水杨酸尿液排泄的作用途径。3.联合用药对转运体介导的水杨酸肾小管分泌的影响为了分析丹红注射液与阿司匹林联合用药减少水杨酸尿液排泄的可能途径"联合用药导致水杨酸肾小管分泌减少,水杨酸尿液排泄减少",进一步评价了联合用药对肾小管转运基因表达和转运功能的影响。采用Real-Time qPCR方法评价联合用药对肾脏摄取转运体(OAT1、OAT2、OAT3)和排出转运体(MCT1、MDR1、MRP4)基因表达的影响,采用稳定表达人源OAT1/OAT3的转基因HEK293细胞系评价丹红注射液对摄取转运体(OAT1和OAT3)转运功能的影响。结果显示,联合用药显著降低肾脏中摄取转运体OAT1的基因表达(P<0.05),对肾脏中其他摄取转运体(OAT2和OAT3)以及排出转运体(MCT1、MRP4和MDR1)的基因表达无显著影响。丹红注射液可浓度依赖性地抑制OAT1和OAT3的转运功能(P<0.05),其中丹红注射液对OAT3的抑制作用要强于对OAT1的作用。结果提示,丹红注射液通过抑制肾脏转运体OAT的基因表达和转运功能,降低肾小管从血液循环中摄取水杨酸的速率,减少水杨酸的肾小管分泌,最终导致水杨酸尿液排泄减少,血药浓度增加。4.联合用药对阿司匹林其他代谢产物尿液排泄的影响为了分析联合用药导致水杨酸血药浓度增加后机体清除阿司匹林的途径,建立了能同时测定尿液样品中龙胆酸、O-羟基马尿酸、水杨酸葡萄糖醛酸苷和O-羟基马尿酸葡萄糖醛酸苷含量的UHPLC-MS/M方法,评价联合用药对阿司匹林其他代谢产物尿液排泄的影响。结果显示,联合用药导致龙胆酸、O-羟基马尿酸、水杨酸葡萄糖醛酸苷和O-羟基马尿酸葡萄糖醛酸苷的尿液排泄总量从66.92 ±16.44μmol增加到了 86.65±5.76μmol。实验结果提示,血液循环中增加的水杨酸通过转化为其他代谢产物(龙胆酸、O-羟基马尿酸、水杨酸葡萄糖醛酸苷和O-羟基马尿酸葡萄糖醛酸苷)进行代偿性排泄。三、基于药效学的丹红注射液与阿司匹林相互作用特征与机制研究药效学相互作用是药动学相互作用的最终结果,对药物的治疗作用和副作用均会产生影响。本章以阿司匹林胃肠道不良反应和抗血小板治疗作用为切入点,建立丹红注射液与阿司匹林药效学相互作用评价体系,评价丹红注射液与阿司匹林联合用药的药效学相互作用特征及机制,为评价丹红注射液与其他药物的药物相互作用提供示范性研究。结果发现,联合用药增强抗血小板作用,同时减轻阿司匹林引起的胃黏膜损伤。联合用药增强抗血小板作用的具体机制为降低阿司匹林酯酶活性,同时增强对环加氧酶COX-1的抑制作用。联合用药减轻阿司匹林引起的胃黏膜损伤的作用机制为联合用药促进胃黏液分泌,降低胃蛋白酶活性,维持胃黏膜屏障结构的完整性;同时修复机体抗氧化能力,降低活性氧簇水平,破坏活性氧簇水平升高与胃黏膜血流量降低之间的恶性循环。(一)丹红注射液与阿司匹林联合用药对阿司匹林胃黏膜损伤的影响1.联合用药对阿司匹林胃黏膜损伤的保护作用研究为了明确丹红注射液与阿司匹林药效学相互作用的靶器官,采用组织学分析方法系统评价联合用药对胃、肺、心、肝和肾组织的影响。结果显示,丹红注射液与阿司匹林药效学相互作用的靶器官是胃组织,对肺、心、肝和肾等器官的影响不显著。阿司匹林连续用药14天可导致腺胃出现多处淤血和糜烂,当丹红注射液与阿司匹林联合用药后,腺胃的淤血和糜烂点显著减少,胃黏膜损伤评分显著下降55.8%。调整丹红注射液与阿司匹林的给药顺序和时间间隔,或者在阿司匹林长期用药过程中加入丹红注射液的短期治疗,均不会影响丹红注射液对阿司匹林胃黏膜损伤的保护作用。2.联合用药保护阿司匹林胃黏膜损伤的作用机制研究为了分析联合用药保护阿司匹林胃黏膜损伤的作用机制,采用PAS染色方法评价联合用药对胃黏液分泌的影响,采用流式细胞术评价联合用药对机体活性氧簇水平(ROS)的影响,并通过测定联合用药对腺胃和胃液中胃蛋白酶活力,对腺胃和血浆中抗氧化酶活力(CAT、GSH-Px、SOD、MDA)的影响,综合分析联合用药保护阿司匹林胃黏膜损伤的作用机制。结果显示,联合用药能促进胃黏液分泌,降低胃蛋白酶活性,维持胃黏膜屏障结构的完整性;同时修复机体抗氧化能力,降低活性氧簇水平,破坏活性氧簇与胃黏膜血流量之间的恶性循环,最终形成对阿司匹林胃黏膜损伤的保护作用。3.联合用药对COX酶活性的影响基于COX-1和COX-2酶在阿司匹林胃黏膜损伤中的关键作用,我们假设丹红注射液可能是通过拮抗阿司匹林对胃黏膜COX-1和COX-2酶活性的抑制作用发挥保护作用的。但是,结果显示,联合用药后对COX-1和COX-2酶活性的抑制作用分别增加了 62.7%(阿司匹林单用38.6%;联合用药62.8%)和34.2%(阿司匹林单用28.9%;联合用药38.8%)。实验结果提示,联合用药增强对COX-1和COX-2酶活性的抑制作用,COX酶可能不是联合用药保护阿司匹林胃黏膜损伤的作用位点。此外,丹红注射液可显著抑制COX-1酶活性(抑制率为61.4%),提示抑制COX-1酶活性可能是丹红注射液发挥活血化瘀的作用机制之一,与阿司匹林联合用药将增强抗血小板作用(效益信号)。(二)丹红注射液与阿司匹林联合用药对抗血小板作用的影响1.联合用药对抗血小板作用的影响增强抗血小板作用是丹红注射液与阿司匹林联合用药的出发点和落脚点,通过测定血浆TXB2和6 keto-PGF1α水平综合评价联合用药对抗血小板作用的影响。结果显示,丹红注射液与阿司匹林联合用药会显著降低血浆TXB2水平降,与丹红注射液单用相比下降29.5%(P<0.001),与阿司匹林单用相比下降30.4%(P<0.001)。但是,无论是丹红注射液或者阿司匹林单独用药,还是丹红注射液与阿司匹林联合用药,均对血浆6keto-PGF1α水平无显著影响。结果提示,丹红注射液与阿司匹林联合用药能显著增强抗血小板作用。2.联合用药增强抗血小板作用的机制分析丹红注射液对阿司匹林酯酶以及COX-1酶活性的抑制作用是联合用药增强抗血小板作用的作用机制。上一章研究也发现联合用药导致的水杨酸血药浓度增加会拮抗阿司匹林的抗血小板作用,但是药物相互作用对抗血小板作用的影响最终是以效益作用为主,表现为联合用药增强抗血小板作用。(三)丹红注射液与阿司匹林联合用药对内源性代谢产物及代谢通路的影响1.联合用药对内源性代谢产物及代谢通路的影响为了确定能表征丹红注射液与阿司匹林药物相互作用的生物标记物和代谢通路,采用代谢组学和多变量数据分析方法综合评价联合用药对内源性代谢产物及代谢通路的影响。最终我们确定了能有效表征丹红注射液与阿司匹林药物相互作用的三类生物标记物(联合用药后消失的标记物、联合用药后增加的标记物、联合用药后减少的标记物)和三条代谢通路(核黄素代谢、戊糖-葡萄糖转化代谢、色氨酸代谢)。2.联合用药对内源性尿毒素硫酸吲哚酚尿液排泄的影响代谢组学研究发现丹红注射液与阿司匹林联合用药会导致内源性代谢产物硫酸吲哚酚的尿液排泄显著减少(P<0.05),可能机制是联合用药抑制OAT的基因表达和转运功能(药动学相互作用),导致OAT介导的的硫酸吲哚酚肾小管分泌减少。硫酸吲哚酚是引起肾脏损伤的关键性尿毒素,如果丹红注射液与阿司匹林联合用药,则可能会减少硫酸吲哚酚在肾脏的蓄积,减轻硫酸吲哚酚对肾脏的损伤(效益信号)。四、丹红注射液与稀释溶媒相互作用特征及稳定性评价中药注射剂与稀释溶媒的相互作用是广义上的相互作用,是指药物与稀释溶媒配伍时发生物理-化学反应对药物的安全性和有效性产生的影响。丹红注射液使用说明书规定配伍的稀释溶媒是5%葡萄糖注射液和0.9%氯化钠注射液,但实际用药过程中,与丹红注射液配伍使用的稀释溶媒要比说明书规定复杂得多,而目前为止还没有研究丹红注射液与稀释溶媒配伍稳定性的系统报道。本章选择临床上常与丹红注射液配伍的六种稀释溶媒,采用化学分析和生物效应评价方法,综合评价丹红注射液与稀释溶媒的配伍稳定性。基于指标性化学成分和整体化学成分的稳定性评价结果显示,与丹红注射液配伍最稳定的稀释溶媒是5%葡萄糖注射液,配伍稳定性最差的是5%木糖醇注射液和6%右旋糖酐40-5%葡萄糖注射液。基于生物效应的稳定性评价结果显示,丹红注射液与5%葡萄糖注射液最为稳定。综合分析结果提示,5%葡萄糖注射液是丹红注射液的最佳稀释溶媒。丹红注射液与不同稀释溶媒配伍应该尽快使用,因为指标性成分、整体成分和抗氧化活性均会随着配伍时间的延长而不断降低。(一)基于化学成分的丹红注射液与稀释溶媒配伍稳定性评价1.基于指标性化学成分的丹红注射液与稀释溶媒配伍稳定性评价为了评价丹红注射液与稀释溶媒配伍对丹红注射液中指标性化学成分含量的影响,建立了能同时测定丹红注射液中丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和紫丁香苷含量的UHPLC-TQ/MS分析方法。结果显示,丹红注射液与5%葡萄糖注射液(GS)配伍最为稳定,与5%木糖醇注射液(XI)和6%右旋糖酐40-5%葡萄糖注射液(DGI)的配伍稳定性最差。2.基于整体化学成分的丹红注射液与稀释溶媒配伍稳定性评价为了评价丹红注射液与稀释溶媒配伍对丹红注射液中整体化学成分含量的影响,建立了能反映丹红注射液中所有化学成分(分子量80-1000Da)相对含量变化的UHPLC-QTOF/MS分析方法和偏移距离计算方法。结果显示,丹红注射液与5%葡萄糖-0.9%氯化钠注射液(GNS)配伍最为稳定,与5%木糖醇注射液(XI)和6%右旋糖酐40-5%葡萄糖注射液(DGI)的配伍稳定性最差。(二)基于生物效应的丹红注射液与稀释溶媒配伍稳定性评价为了评价丹红注射液与稀释溶媒配伍对丹红注射液生物效应的影响,建立了HUVEC氧化性损伤模型和Vc当量抗氧化能力(VCEAC)分析方法。结果显示,丹红注射液与5%葡萄糖注射液(GS)配伍最为稳定,与5%木糖醇注射液(XI)和5%葡萄糖-0.9%氯化钠注射液(GNS)的配伍稳定性最差。五、丹红注射液对糖尿病心肌病保护作用及作用机制研究基于丹红注射液治疗糖尿病心肌病的临床实际,本章建立了糖尿病心肌病小鼠模型和高糖高脂诱导的心肌细胞损伤模型,发现HBP异常、UPR异常以及脂质代谢异常与糖尿病心肌病密切相关,明确了丹红注射液对糖尿病心肌病的保护作用,以及XBP1在丹红注射液保护糖尿病心肌病过程中的关键作用。(一)丹红注射液对糖尿病心肌病的保护作用1.丹红注射液对糖尿病心肌病小鼠心脏功能障碍的保护作用建立糖尿病心肌病小鼠模型,采用心脏超声技术评价丹红注射液对糖尿病心肌病小鼠心脏功能障碍的保护作用。结果显示,丹红注射液对健康小鼠的心脏功能无显著影响,但是可以显著改善糖尿病心肌病小鼠的心脏收缩功能障碍(FS%增加20.5%;P<0.05),对舒张功能障碍有改善的趋势,但不具有显著性差异(MV E/A降低12%)。实验结果提示,丹红注射液对糖尿病心肌病小鼠的心脏收缩功能障碍具有显著的保护作用。。2.丹红注射液对高糖高脂诱导的乳鼠心室肌细胞损伤的保护作用为了进一步评价丹红注射液对糖尿病心肌病的保护作用,我们体外模拟糖尿病状态下心肌细胞所处的高糖高脂环境,通过葡萄糖和棕榈酸钠诱导乳鼠心室肌细胞损伤模型,评价丹红注射液对心肌细胞损伤的保护作用。结果显示,丹红注射液对高糖条件下低浓度(62.5 μM)和高浓度(250 μM)棕榈酸钠引起的NRVM细胞损伤均具有显著的保护作用。丹红注射液导致低浓度棕榈酸钠引起的细胞死亡率下降了 44.5%(P<0.001),对高浓度棕榈酸钠引起的细胞损伤降低保护作用较弱,细胞死亡率仅降低了 12.0%(P<0.05)。实验结果提示,丹红注射液对高糖高脂诱导的心肌细胞死亡具有显著的保护作用。(二)丹红注射液对糖尿病心肌病的保护作用机制研究为了分析丹红注射液对糖尿病心肌病的保护作用机制,首先采用分子方法研究了 HBP异常、UPR异常以及脂质代谢异常与糖尿病心肌的关联系。结果显示,糖尿病心肌病会导致心脏GNPNAT1蛋白表达和基因表达显著抑制(HBP异常),ATF6、GRP94、GRP44、ATF4、CHOP、ERO1、XBP1、ERDJ4 和 IRE1 基因表达显著抑制以及GRP78和GRP94蛋白表达显著抑制(UPR异常),此外,糖尿病心肌病小鼠的左心室会出现明显的脂质堆积。实验结果提示,HBP异常、UPR异常以及脂质代谢异常与糖尿病心肌病密切相关。为了评价XBP1在丹红注射液保护糖尿病心肌病过程中的作用,采用XBP1基因敲除小鼠诱导糖尿病心肌病,评价丹红注射液的保护作用。结果显示,丹红注射液能显著改善野生型糖尿病心肌病小鼠的心脏收缩功能障碍,如果将XBP1基因敲除,丹红注射液对心脏收缩功能的保护作用将被显著削弱。实验结果提示,XBP1可能参与了丹红注射液对糖尿病心肌病的保护作用。