【背景】胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是恶性程度最高的肿瘤之一，其中，胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)占90%以上。由于早期临床症状隐匿，诊断困难，绝大部分PDAC患者在确诊时肿瘤已出现转移或侵袭到胰外器官而无法行根治性手术切除；此外，PDAC对放疗和化疗均不敏感，患者的中位生存时间不到6个月，5年生存率小于5％，预后极差。近年来，我国及西方国家的PDAC发病率及死亡率均呈上升趋势。随着生物技术的迅速发展，PDAC的相关分子生物学研究对于阐明PDAC发病机制，提高PDAC诊治水平，改善患者预后具有重要意义。MicroRNA (miRNA)是由17～25个核苷酸所组成的非编码小分子单链RNA，具有高度保守性，通过与靶基因mRNA的3’端的非翻译区（3’-UTR）结合，降解或者抑制mRNA的翻译，实现对靶基因的负调控。研究发现，miRNAs在许多生物学进程中发挥重要作用，其异常表达与多种疾病相关。在肿瘤研究领域，miRNAs涉及肿瘤发生、发展、代谢、耐药等多个方面，并具有组织特异性，通过调控众多肿瘤相关基因的表达，发挥类似于原癌基因或者抑癌基因的作用。目前，有关miRNAs在PDAC的研究涵盖了肿瘤细胞增殖、凋亡、分化、侵袭转移和耐药等方面。对比分析PDAC细胞系、组织样品、体液及小动物模型相对于正常组的miRNA表达谱变化，发现其表达谱存在显著差异，一部分miRNAs的表达上调，如miR-21，miR-155，miR-10b，miR-196，miR-221，miR-301，miR-95等，而另一些miRNAs则表达下调，如miR-217，miR-216，miR-375，miR-203等。这些异常表达的miRNAs调控的靶基因有KRAS，PTEN，PDCD4，ZEB1，BCL-2，TIMP3等等。但是现阶段的研究仍存在很多尚未阐明的问题，关于PDAC中miRNAs及其靶基因的调控网络构建和作用机制方面还需进一步的研究。miR-135a被证实在许多肿瘤中发挥抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡等作用，但在胰腺癌中的作用尚未见有相关研究。Bmi1(B-ceIl-specific Moloney murine leukemia virus integration site1)基因，属于多梳基因PcG (polycomb group genes)家族。Bmi1基因在细胞周期、细胞永生化和衰老的调解中发挥重要作用。近年来，许多研究证实了Bmi1基因还参与了干细胞的自我更新和分化。Bmi1基因与肿瘤关系密切，通常被认为是一个重要的癌基因。肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肝癌和胰腺癌等多种肿瘤的发生发展都和Bmi1的异常表达有关。通过生物信息学预测与分析，我们推测Bmi1基因是miR-135a的潜在靶基因之一。miR-135a是否参与PDAC的发生和发展？其在PDAC中的功能是什么？这些功能是否是通过调控Bmi1来实现的？因此，miR-135a在PDAC发生、发展中的作用和机制还需进一步研究。【目的】通过miRNA表达谱芯片筛选PDAC细胞系及正常胰腺导管上皮细胞系中发生差异表达的miRNA分子，确定研究对象（即miR-135a）后探讨其在PDAC发生发展中的相关功能和机制，为PDAC的诊疗寻找新的靶点。【方法】1．本实验选用高通量的Agilent Human microRNA array kit (V18.0)检测3种PDAC细胞系（PANC-1、BxPC-3和ASPC-1）及1种正常胰腺导管上皮细胞系（HPDE6c7）中的miRNAs表达情况。并采用实时定量PCR（qRT-PCR）的方法在肿瘤组织及细胞系中验证部分差异表达的miRNAs，结果证明芯片检测准确、可靠，并且挑选miR-135a作为研究对象。2．构建过表达miR-135a的慢病毒载体Lenti-miR-135a，转染PDAC细胞系，通过细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8），克隆形成实验、EdU细胞增殖检测实验、流式细胞术、Transwell实验及Matrigel实验等方法观察其对细胞增殖、生长、侵袭和迁移的影响。并通过裸鼠皮下成瘤实验来观察miR-135a对PDAC增殖能力的影响。3．miR-135a下游靶基因的预测、验证及相关机制研究：利用miRanda、Pita,及RNAhybrid等靶基因预测软件，结合相关因素进行分析，筛选出Bmi1可能为miR-135a的下游靶基因。在PDAC细胞中过表达或抑制miR-135a后利用实时定量RT-PCR和免疫印迹实验（western blotting）检测Bmi1基因mRNA和蛋白水平的改变。之后采用荧光素酶报告实验验证miR-135a对Bmi1的调控作用。然后，westernblotting检测上述转染细胞中细胞周期及凋亡相关分子p21，cyclin D1，Cdk2，Cdk4，Akt，pAkt，Bcl-2，Bax的变化。【结果】1．Agilent human miRNA芯片检测结果显示，与正常胰腺导管上皮细胞系相比，PDAC细胞系中表达上调的miRNA有23个（fold change>2），包括miR-21，miR-10a-5p，miR-10b-5p和miR-301a-3p等，表达下调的有43个（fold change <0.5），如miR-205-3p，miR-203，miR-630以及miR-135a等。结合既往文献报道的差异表达的miRNAs，芯片检测结果可准确性及可靠性高。通过芯片筛选及查阅相关文献，我们发现miR-135a在肺癌、肾癌、胃癌等恶性肿瘤中的表达均有明显的降低并和细胞增殖、凋亡等恶性表型相关，但是在PDAC中的表达变化及其功能未见报道。所以我们选择miR-135a作为进一步的研究对象。为验证芯片筛选结果，我们还采用实时定量RT-PCR对miR-135a在PDAC细胞系及组织中的表达状况进行了验证，发现相较于癌旁正常组织和正常胰腺导管上皮细胞系，miR-135a在PDAC组织和细胞系的表达均显著下调，结果与芯片结果相一致。提示miR-135a在PDAC的发生发展过程中可能发挥重要作用。2．转染Lenti-miR-135a后，采用CCK-8检测细胞生长曲线结果提示，与对照组相比，转染组细胞增殖能力减弱；平板克隆形成实验结果提示，与对照组相比，转染组细胞克隆形成能力减弱；EdU实验结果提示，与对照组相比，转染组细胞增殖能力减弱。流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡实验结果提示，与对照组相比，转染组细胞增加了G0G1期细胞的比例，G2/M期的细胞的比例下降，并且增加了凋亡细胞的数量。裸鼠皮下成瘤实验提示，与对照组相比，注射转染组细胞的裸鼠成瘤能力显著减弱。Transwell小室实验的结果则提示miR-135a对PDAC细胞的迁移与侵袭能力无明显影响。3．生物信息学预测提示，Bmi1可能是miR-135a作用的靶基因之一，采用westernblotting检测PDAC细胞系及组织中的Bmi1基因的蛋白表达情况，发现其表达与miR-135a的表达呈负相关。过表达或抑制miR-135a对Bmi1基因的mRNA水平无明显影响，但却对其蛋白水平则呈负性调控作用。荧光素酶报告基因实验证实miR-135a可以抑制含有其结合位点的报告基因的活性，而对含突变位点的质粒及对照质粒没有影响。进一步验证了生物信息学软件的预测结果。4．western blotting检测PDAC细胞中细胞周期相关分子p21，cyclin D1，Cdk2，Cdk4的变化。发现与对照组相比较，过表达miR-135a后细胞中cyclin D1，Cdk2，Cdk4的表达明显下调，p21的表达则上调。而同时转染miR-135a mimics与pcDNA-Bmi1(mutant3’-UTR for miR-135a)后，与仅过表达miR-135a组细胞相比，上调了cyclin D1，Cdk2，Cdk4的表达，p21的表达则下调。western blotting检测细胞凋亡相关分子表达发现，与对照组相比较，过表达miR-135a后细胞中phospho-Akt和Bcl-2的表达受到抑制，Bax表达水平则升高，同时转染miR-135a mimics与pcDNA-Bmi1(mutant3’-UTR for miR-135a)后，与仅过表达miR-135a组细胞相比，phospho-Akt和Bcl-2表达升高，Bax的表达被抑制。【结论】1．高通量miRNA芯片检测结果及实时定量RT-PCR实验提示miR-135a在PDAC细胞系和组织中的表达较正常胰腺导管上皮细胞系和癌旁正常组织中明显降低，提示miR-135a在PDAC的发生和发展过程中可能发挥抑癌基因的作用。2．过表达miR-135a能抑制PDAC细胞体外和体内增殖能力，促进细胞凋亡，，提示miR-135a在PDAC增殖和凋亡中起重要作用。3．miR-135a通过负性调节其靶基因Bmi1的表达，从而抑制PDAC的增殖，有可能成为PDAC治疗的新靶点。