论文部分内容阅读
目的观察应用RNAi技术下调Neuropilin-2(神经纤毛蛋白-2,NRP-2)表达后对体外培养的结肠癌细胞HCT-8增殖能力的影响。方法规范培养结肠癌细胞HCT-8,待细胞生长至对数期后,利用脂质体Lip-2000将NRP-2的荧光siRNA转染至HCT-8细胞中,常规培养48h后利用荧光显微镜观察细胞HCT-8的转染效率。根据转染物质的不同,将结肠癌细胞分为三组,即转染组(转染siRNA-NRP-2),阴性对照组(转染siRNA-NControl)和空白对照组(转染缓冲剂PBS)。通过反转录实时定量聚合酶连反应(Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测每组细胞NRP-2mRNA的表达量;Western blot检测每组细胞中NRP-2蛋白的表达量;CCK-8实验通过每组细胞的光密度值(optical density,OD值)检测细胞的增殖情况;应用免疫细胞化学染色检测每组细胞Ki-67蛋白的表达情况;通过平板克隆实验观察每组细胞的增殖能力;通过吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色法检测每组细胞的凋亡比例。每组实验各重复3次以上。采用SPSS 22.0软件进行统计学处理,计量资料采用`x±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,P<0.05认为差异有统计学意义。结果1通过脂质体Lip-2000瞬时转染荧光siRNA 48h后,利用荧光显微镜计数转染成功的细胞,三次实验转染效率均在80%以上。2应用逆转录实时定量聚合酶链反应测定每组细胞NRP-2 mRNA的表达,转染组NRP-2 mRNA表达量明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。3应用Western blot检测每组细胞NRP-2蛋白的表达,相较于阴性对照组和空白对照组,转染组NRP-2蛋白的表达明显降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。4 CCK-8实验结果显示,当细胞培养至24h、48h、72h、96h,转染组的OD值明显低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。5免疫细胞化学染色法检测每组细胞Ki-67蛋白的表达,与阴性对照组和空白对照组相比,转染组细胞的染色指数明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。6 AO/PI染色法结果显示,相较于阴性对照组和空白对照组,转染组细胞的凋亡比例明显增高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论通过RNAi技术可沉默NRP-2的表达,进而降低结肠癌细胞HCT-8的增殖能力,并且促进其凋亡。图7幅;表7个;参125篇。