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冠状动脉术后再狭窄（Restenosis）是指成功的冠状动脉旁路移植术（CABG）或经皮介导的冠状动脉成形术（PTCA）后再次发生血管狭窄，其发生率约为30％-50％。再狭窄的发生使手术的疗效明现减低。再狭窄是局部血管对于机械性损伤的过度修复反应，与血管中层平滑肌细胞（VSMC）向内膜下的迁移、增生和细胞外基质的分泌密切相关。血小板衍化生长因子（PDGF）及其β受体在此过程中起重要作用。目前，再狭窄的防治措施均不理想。放射性反义寡核苷酸（Radiolabeled AODN）是将反义寡核苷酸（AODN）的基因靶向性和反基因作用与放射性核素的放射治疗作用相结合的产物。本研究通过体外原代培养大鼠血管平滑肌细胞，建立血管严滑肌的体外增殖模型；采用32P标记PDGFR-β反义寡核苷酸，观察32P标记反义寡核苷酸在细胞内的作用部位、对血管平滑肌细胞细胞周期、目的基因表达、增殖、迁移和凋亡的影响，为血管术后再狭窄的防治提供新的方法。 材料和方法 苏·军出上甘硕士甘位十式 体外分离的4周龄Sprague－Dawley大鼠胸主动脉平滑肌细胞，建立体外增殖模型。人工合成的三段不同序列 PDGFR－p反义寡核百酸 AODN’门)5·WCACTCCTGGAAGCCC3、AODN’（靶位421）STCTGAGCACTAAAGCTGG3（靶位22．39）、AODN‘（靶位12．27）SAAGCCCTCTGAGCAC3”，正义寡核昔酸 5 GGG CTT CCA GGA GTG ATA3及f音义寡核百酸5 GTG ATA GTA TGC CGA GCA3 所有寡核昔酸均经全硫代修饰。通过观察各种寡核百酸对血管平滑肌细胞增殖抑制率（MTT法厂细胞周期（流式细胞仪）、迁移抑制率（Boyden s小室法）、目的基冈表达（免疫组织化学染色法）等的影响，挑选出抑制效应最强的片段序列。对该反义寡核百酸片段进行‘中的标记。利用激光共聚焦显微镜观察平滑肌细胞对异硫氰酸荧光素（FITC）标记的反义寡核盲酸的摄取和胞内定位，观察”P标记的反义寡核谷酸对平滑肌细胞迁移的影响，生长抑制率，细胞周期，细胞凋亡和目的基因表达的影响。 结果 卜 培养液内加入 FITC标记的 AODN 24、48 ’J＼时后，井光分别位于胞 浆内和胞核内： 2．MTT法测定各组细胞的 MTT OD值发现，5 u mol／LPDGFR－p反 义寡核昔酸（AODN’）作用后的VSMC的增殖强度（0．12 fo．02） 明显弱于空白对照组（0．34土0．03，P／0．OJ）、止义组（0．31 fo．02， P／0．OJ）和错义组（0．30上0．03，Prp、oj人 以浓度为10umol／L的 PDGFR－p反义寡核昔酸干预VSMC48h后，处厂DNA合成前期 （口JGI）细胞数量和酉分比高于空白对照组（P＜0刀5）；PDGFR－6免 疫细胞化学染色发现以 5 u mol／L以上浓度 PDGFR－e反义寡核百酸 干预48h后VSMC各组胞膜染色强度明显弱于主白对照组和其它组 上述所有抑制作用中，AODNI组抑制作川最强。 4 第。尊由上舍硕十甘健公久3．反义寡核昔酸 10urnol／L（AODN’）组（门l士 1刀）加药 36小时后， 被血小板衍化生长因子诱导迁移通过Boyden，s ，J＼室碳纤维素膜的细 胞数量少于空白对照组（70．2士 2．2，P O．05）、上义织（67．8土 2．0， Pf00））、错义组（68．3土3．2，Pf00））、AODN’组（33二士1．7， Prp．05）和AODN’(40．3士2．9，P／0．05人该抑制作用片浓度和时 间依赖性：正义、错义寡核昔酸和 SUUOI／L以卜浓度迁移抑制不明 显（PA10j）o4．加入 AODN‘后 24小时细胞形态和超微结构＋j加i！i前无明显改变， 48小时细胞形态和超微结构较加药前有明显改变：加药后24小时 TU’NEL染色各组未发现凋亡细胞，48小时后AODN‘绢细胞爬片染 色有较多凋亡阳性细胞出现。5．以浓度为0．25 p CxZ．oumol／U的”P标记PDGFR．日AODN’干预 VSMC48h后，处于 DNA合成前期（GofGI）细胞数量和白分比高于空 白对照组(P＜0刀引和 2刀＜IT’IOI／L的 AODN’织（尸＜0．05）；PDGFR－ p免疫细胞化学染色发现以 2．ournol／L（．25 u Ci似上浓度 PDGFR－ 日反义寡核昔酸干预48h后VSMC各组胞膜染色强度明显弱于空白 对照组和其它组：＊＊T法测定各组细胞的＊＊TOD值发现，0二5 卜Cip刀Umol几）H中标记pDGFR－p反义寡核i酸作川48小时后的 VSMC的增殖强度（0．27土0．01）明显弱于主白对照组（0．39土0．of， P CO．oj）及同浓度放射性正义组（0．33士 0．05，P fo．oj）和反义寡核 昔酸组（0．36f0．06，P／0．OJ）和”P－ATP组（0．34t0．09，P＜0．05）， 该抑制作用呈明显的浓度依赖性。6．加入 2刀umol／L（0．25 u Ci）AODN’24小时后细胞形态和超微结构 较加药前有明显改变；加药48 ’J’时后2刀urnol／L AODN’(0．2