辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)是一种来源于辣根的分泌型植物过氧化物酶,在医学诊断、检测分析、生物修复等领域有着广泛应用,市场需求量大。然而,目前该酶的工业生产方法主要是直接从辣根中提取制备,工艺复杂且成本较高。此外,分离提取的天然HRP为含40多种同工酶的混合物,无法获得大量单一组分的酶,一定程度上影响了酶制剂的质量,并且限制了对HRP结构与功能的基础研究。因此,研究利用合适的重组表达系统生产制备高催化活性的单一型HRP具有重要的理论意义和工业应用价值。辣根天然HRP中C1A同工酶的含量最为丰富且活性高,本研究遂以HRP C1A为研究对象,开展异源表达实验及基础应用研究。论文的主要研究成果如下:(1)实现了 HRP C1A在大肠杆菌中的异源重组表达,然而未能获得可溶性表达,重组酶基本全部存在于无活性的、不可溶包涵体中。对包涵体形式的HRP C1A进行了变复性研究,利用两步滴加稀释超速离心法,通过摸索复性条件,建立出优化的重折叠缓冲液体系(含0.4 mmol·L-1 GSSG,0.05 mmol·L-1 DTT,10%(v/v)甘油,1.7 mol·L-1 尿素和 2 mmol·L-1 CaCl2,pH 8.5 的 20 mmol·L-1 Tris-HCl),最终获得比酶活为 2636 U·g-1 的重组HRP C1A。分析了复性重组HRP C1A的酶学性质,并发现Fe3+和Cu2+对其有较强的激活作用。(2)为达到重组酶循环使用目的,利用自行制备的琼脂糖-壳聚糖水凝胶载体对HRP C1A进行了固定化研究。结果显示固定化效率可达86.9±2.5%,且经6次循环后其催化活性仍保持在80%以上。对固定化酶进行了扫描电子显微镜(SEM)表征。对比了固定化前后重组酶酶学性质的变化,发现固定化酶的最适pH由原来的5.5迁移至7.0,最适温度由30℃变为50℃;对金属离子和有机溶剂的耐受性能力也有所提高,其中以Co2+和二甲基亚砜(DMSO)最为明显。(3)采用染料脱色实验对重组酶HRPC1A的催化活性进行初步评估。结果表明重组HRPC1A对部分染料具有较好的脱色效果,其中对酸性蓝129、甲基蓝、甲基红和台盼蓝的脱色率分别达到76.28%、75.03%、72.42%和72.78%,以酸性蓝129的脱色效果最显著。(4)利用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)技术对HRP C1A催化降解酸性蓝129的脱色液进行产物分析,离子碎片显示酸性蓝129在重组酶催化下,蒽醌基团侧链上的C-N键首先发生断裂,随后活性氢攻击蒽醌基团的C=O双键。在多次氧化还原作用后,部分物质生成不溶性1-硝基蒽醌从溶液中析出;另一部分物质继续被HRP C1A催化降解为邻苯二甲酸和2-氨基-5-羟基苯磺酸。首次提出辣根过氧化物酶催化酸性蓝129的可能降解机理。