选题依据:柴胡的保肝利胆作用近年来已经被大量的研究报道,关于柴胡及含柴胡的中药复方的利胆作用研究虽然很多,但是其作用机制研究较少。已有研究证实柴胡皂苷是柴胡发挥保肝利胆作用的主要有效成分,但具体发挥活性的单体成分尚不明确,仅见少量对柴胡皂苷a、d利胆作用的报道。本课题组前期研究已经明确柴胡醇提物中皂苷类成分多于水煎液,且柴胡皂苷a、b₂、d为主要成分,但是柴胡醇提物是否具有利胆作用、具体哪些皂苷成分起到利胆作用、药物的作用机制是什么以及其在体内的动态变化规律等问题都不清楚,因而,研究柴胡皂苷的利胆作用及其机制,进而探讨发挥活性的主要成分成为必不可少的研究内容。目的:研究柴胡皂苷类成分的利胆作用,在分子水平探讨柴胡皂苷类成分的利胆作用机制,考察发挥活性的主要成分,并对其药代动力学特征进行考察。为柴胡的临床应用及新药的研发提供合理依据。方法:1.将30只C57BL/6小鼠随机分成5组,分别为空白组（K）、柴胡皂苷a组（SSa）、柴胡皂苷b₂组（SSb₂）、柴胡皂苷d组（SSd）和柴胡醇提物组（ESS）。柴胡提取物（ESS）与各柴胡皂苷单体（SSa、SSb₂、SSd）分别灌胃给予小鼠后,对小鼠肝脏和血清中的生化指标进行分析。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆固醇（TC）以及甘油三脂（TG）分别采用全自动生化分析仪进行测定,胆汁酸的测定按照试剂盒操作,用酶比色微板法测量总胆汁酸（TBA）。2.建立小鼠肝脏、胆汁、盲肠内容物中胆汁酸定量代谢组学分析的UPLC-MS方法。色谱条件:Waters HSS T3色谱柱（1.8μm,2.1×100 mm）;流动相:0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）;洗脱程序:0⁴ min,20%²0%B;4¹5 min,20%⁴0%B;15²0 min,40%⁶0%B,20²2 min,60%⁶0%B,22²2.5 min,60%⁹0%B,22.5²3.5 min,90⁹0%B,23.5²5 min,90²0%B,25²6 min,20%²0%B;流速:0.3 mL/min;柱温:45°C;全波长扫描。质谱条件:选用Full Scan扫描模式,正负切换同时扫描及Target扫描模式,运用Xcalibur 3.0软件对生物样品进行一级质谱数据采集,仪器参数为:ESI源,喷雾电压（+）:3.0 KV;喷雾电压（-）:2.7 KV;毛细管温度:320°C;加热器温度:300°C;鞘气压力:35arb;辅助气压力:10arb;分辨率（Full Scan）:70000;分辨率（dd-MS2）:17500,NCE为:12.5,25,37.5 eV;扫描范围:m/z 50¹200。3.通过q-PCR技术对SSa、SSb₂、SSd以及ESS给药后小鼠肝脏和回肠中Fxr相关基因mRNA的表达进行分析,探讨柴胡皂苷的利胆作用机制。4.建立UPLC-MS法同时测定柴胡皂苷a、b₁、b₂、c、d五种成分的含量测定方法,并用于柴胡醇提物与各柴胡皂苷单体灌胃给予小鼠后的血清药代动力学研究。将40只C57BL/6小鼠随机分成4组,分别为柴胡皂苷a组（SSa）、柴胡皂苷b₂组（SSb₂）、柴胡皂苷d组（SSd）和柴胡醇提物组（ESS）,于给药前及给药后不同时间点取血,测定不同时间小鼠血清中的药物浓度,得到药-时曲线,通过DAS软件计算药动学参数。色谱条件:Waters HSS T3色谱柱（1.8μm,2.1×100 mm）;流动相:0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）;洗脱程序:0¹3 min,33%³3%B;13¹4.5 min;33%⁴0%B;14.5¹5.5 min,40%³3%;15.5¹7 min,33%⁴0%,17²4 min,40%⁶0%;24²5 min,60%³3%;柱温为40°C;进样量5μL;流速为0.3 mL/min。MS条件:正离子模式;多反应监测模式（MRM）;电喷雾离子源:ESI源;扫描方式:MRM;干燥气（N₂）压力:50 psi;气帘气（N₂）压力:35 psi;雾化气（N₂）压力:50 psi;喷雾电压:5500V;离子源温度:500°C;气体流速:12 L/min。结果:1.灌胃给予小鼠不同柴胡皂苷14天后,肝体比重以及血清和肝脏中生化指标的测定结果显示,不同给药组的肝脏重量与体重的比值均下降,其中SSa和SSd组的比值较空白组显著降低。与空白组相比,SSa和SSb₂组的血清TBA显著升高,肝脏中SSb₂和ESS组的TBA显著降低;血清中,SSa、SSb₂和ESS组TC含量显著降低,在肝脏中,SSd组的TC含量显著降低;SSa和SSb₂组中肝脏TG显著降低,SSd组血清TG显著升高;SSd组血清ALP显著降低,不同给药组对血清AST均无显著性差异,ESS组血清ALT显著升高。这表明不同给药组对小鼠的肝功能几乎没有影响,且可促进肝脏胆汁酸的排泄。2.采用UPLC-MS对灌胃给予不同柴胡皂苷后小鼠肝脏、胆汁、盲肠内容物中的16种胆汁酸成分进行分析。比较不同给药组中胆汁酸成分含量的变化,结果显示,在肝脏组织样品的胆汁酸含量测定结果中,SSa组:β-MCA、ω-MCA、T-CDCA含量显著升高;SSb₂组中HDCA、DCA、T-HDCA、T-DCA含量显著降低;SSd组中β-MCA、T-CDCA显著升高,DCA显著降低;ESS组中β-MCA、ω-MCA、T-CDCA显著升高,T-α-MCA、TCA、T-UDCA、T-HDCA和胆汁酸总和的含量显著降低。胆汁中:SSb₂组的β-MCA、T-β-MCA显著升高;SSd组的T-DCA显著升高;ESS组中ω-MCA显著降低。在盲肠内容物中:SSb₂组的HDCA显著降低;ESS组的UDCA、HDCA显著降低。测定结果与TBA结果基本相似,且不同皂苷成分对胆汁酸的调控作用不同。3.通过q-PCR技术对不同给药组中小鼠肝脏和回肠中Fxr相关基因mRNA的表达进行分析,结果显示,肝脏组织中:SSa组Fxr、Shp、Cyp7a1、Ntcp、Abcc4、Cyp27a1 mRNA表达水平显著升高;SSb₂组中Shp mRNA表达水平显著升高;SSd组的Cyp7a1、Abcc4、Cyp27a1、Hmgcr mRNA表达水平显著升高;ESS组中Bsep mRNA表达水平显著降低;Abcc4、Cyp27a1、Hmgcr mRNA表达显著升高。回肠组织中:SSa组的Mdr1 mRNA表达水平与空白组相比显著升高;SSd组的Ibabp、Osta、Ostb、Mdr1 mRNA表达水平显著升高;ESS组中Asbt、Osta、Ostb、Mdr1 mRNA表达显著升高。SSa、SSd和ESS组中Mdr1 mRNA表达水平均显著升高。4.在药代动力学实验中,建立了皂苷类指标成分的UPLC-MS含量测定方法,得到了各成分血药浓度、药-时曲线图、药动学参数,结果显示灌胃给予SSa后其达峰时间在0.47 h左右,半衰期在0.90 h左右,同时还检测到了一种代谢物M,其Tmax为1.47 h,t_1/2在3.16 h左右。灌胃给予SSd其达峰时间在0.48 h左右,半衰期在0.68 h左右,SSb₂的达峰时间在0.78 h左右,半衰期在2.74 h左右,在ESS组并未检测到柴胡皂苷类成分。结论:不同柴胡皂苷及柴胡醇提物给药14天后,小鼠的肝功能几乎没有损伤,且可促进肝脏中胆汁酸的排泄。在肝脏中,SSa、SSd和ESS通过诱导Abcc4mRNA表达促进胆汁酸从肝细胞进入体循环进而降低胆汁酸的含量;在回肠中,SSa、SSd和ESS通过诱导Mdr1 mRNA表达促进其外排来调节胆汁酸的含量,且SSa和SSd可能为ESS的主要活性成分。SSa、SSb₂、SSd在体内均有消除快、吸收快等特点。提示中药多成分、多靶点相互协同作用。