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在翻译结束之后,许多蛋白必须经过适当的修饰才具有其生物学功能,糖基修饰是其中最普遍的一种方式,尤其对鞭毛丝亚基蛋白而言。在许多致病菌株中,鞭毛丝亚基蛋白的糖基化修饰已经得到了很好的研究。但是关于Shewanella oneidensis这类蛋白的糖基修饰还未见报道。S.oneidensis的运动依赖于由两种鞭毛丝亚基蛋白亚基FlaA和FlaB组装而成的单极性鞭毛。尽管FlaA和FlaB的氨基酸序列非常保守,但二者在功能上存在显著差别:FlaB为主要功能的鞭毛丝亚基蛋白而FlaA功能极其有限。在本论文中,我们利用nanoLC-MS/MS及一系列的生物技术,系统研究了FlaB鞭毛丝亚基蛋白的翻译后修饰,确定了与功能直接相关的氨基酸残基,并分析了造成FlaA和FlaB功能差异的主要原因,取得了以下结果:
1.构建了适合在不影响功能前提下过量表达鞭毛丝亚基蛋白的遗传体系;利用该系统表达、提取和纯化了具主要功能的FlaB;利用nanoLC-MS和nanoLC-MS/MS分析了用胰蛋白酶消化形成的多肽。2.结合半胱氨酸突变扫描技术,分析发现了S.oneidensisFlaB鞭毛丝亚基蛋白的五个丝氨酸残基被O-linked糖基修饰,并且在同一位点修饰糖基的分子量经常存在14Da的差异。这说明翻译后修饰的糖由两部分组成:一部分是分子量恒定的糖基(274Da),另一部分是分子量以14Da为差异单位可变的糖基,该14Da为差异单位推测为甲基。3.FlaB中大量的赖氨酸被甲基修饰。通过研究确定了S.oneidensis的甲基转移酶为FliB(SO4160),是与Salmonella enterica serovar Typhimurium甲基转移酶同源的蛋白。
4.为了解开S.oneidensis序列高度相似的两个鞭毛丝亚基蛋白FlaA和FlaB的巨大功能差异之谜,系统分析了这两个蛋白的编码基因启动子、T3SS蛋白分泌指导序列、鞭毛丝亚基蛋白三维结构及两个蛋白可变区内的不同氨基酸等对其功能的影响。研究发现FlaA和FlaB尽管在启动子活性和蛋白分泌方面存在一定不同,但这些不足以解释其功能上的巨大差异。与之相反,在蛋白序列和结构上的些微区别却决定了FlaA和FlaB的显著不同生物学作用。在第三个α-螺旋(α3)的C-端和Loop3链接区的氨基酸决定了FlaB为主要功能的鞭毛丝亚基蛋白,其中FlaB的T129位点和T134位点为关键的氨基酸。Shewanella的Loop4是可变区中保守性最高的区域,用丙氨酸突变扫描FlaB中Loop4的保守氨基酸,三个位点的扫描分别导致细胞几乎丧失了所有的运动能力,所以鞭毛丝亚基蛋白的F148、Q149、V150位点是保守而不可替换的。用丙氨酸突变扫描FlaB可变区的22个丝氨酸或苏氨酸时,T179位点的扫描导致细胞几乎不动;可能是因为鞭毛组装时,179位点苏氨酸中的羟基可以与相邻蛋白的氨基酸形成氢键,稳定鞭毛大分子的结构。