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肝纤维化的防治是国内外学者研究的重点和难点,阻止肝纤维化的形成与发展,对延缓慢性肝病向肝硬化的转变具有重要意义。中药复方在治疗慢性复杂性疾病方面具有显著优势,但由于中药复方存在成分不明确和作用机理不清楚等问题,使其在临床运用上受到很大的限制。先导化合物G-TOA是以中医理论为指导,在中药复方鳖甲软肝片配伍的基础上,利用拼合原理形成的新化合物。肝纤维化是肝脏组织中细胞外基质(ECM)成分过度增生与异常沉积所导致的肝脏结构和(或)功能的异常改变,而肝星状细胞(HSC)是肝纤维化时ECM的主要来源,是肝纤维化形成的中心环节。抑制HSC激活、诱导其凋亡是肝纤维化治疗的主要思路。本课题组前期的研究发现先导化合物G-TOA对肝星状细胞有明显的抑制作用。本实验进一步观察该化合物对HSC增殖和凋亡的影响,探讨其抗肝纤维化可能的作用机制。目的：以体外培养的活化肝星状细胞(HSC-T6)为对象,研究先导化合物G-TOA对细胞增殖和凋亡的影响,观察G-TOA对NF-κB、p65、COX-2、Bax、 Bcl-2等蛋白表达的影响,从细胞和分子水平探讨G-TOA诱导肝星状细胞凋亡可能的作用机制。方法：1.MTT法检测G-TOA对HSC-T6和正常肝细胞(L02)细胞增殖的影响：将不同浓度的G-TOA(0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM)分别作用于HSC-T6和L02细胞,分别在药物作用24h、48h、72h后,采用MTT法观察。选择适宜作用时间、浓度,为进一步探究作用机制做准备。2.流式细胞术检测G-TOA对HSC-T6细胞凋亡的影响：采用流式细胞仪检测G-TOA对HSC-T6细胞周期和细胞凋亡的影响,进一步探讨G-TOA对HSC-T6细胞线粒体膜电位和游离钙水平的影响。3.形态学方法检测G-TOA对HSC-T6细胞形态的影响及其作用机制：采用HE染色法,光镜观察药物作用后细胞形态的改变。免疫细胞化学法检测HSC-T6中NF-κB/p65、COX-2蛋白的表达。4.免疫蛋白印迹法检测G-TOA对HSC-T6细胞凋亡的影响：Western Blot法检测G-TOA对HSC-T6细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。结果：1.G-TOA在体外可以明显的抑制HSC-T6细胞的增殖,作用强度呈剂量-时间依赖关系：G-TOA对L02细胞的生长具有双向调节作用,低浓度促进细胞增殖,高浓度(≥5μM)抑制细胞增殖,故选取药物作用时间为48h,以2μM、3μM、4μM作为实验的浓度进行后续实验。2.不同剂量(2μM、3μM、4μM)的G-TOA作用HSC-T6细胞后：①G1期和G2期细胞比例无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)；②各浓度G-TOA诱导HSC-T6的凋亡率分别为7.70+0.290%、14.30+1.153%、22.40+0.536%,与对照组(4.77+0.218%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)；③各浓度G-TOA引起HSC-T6线粒体膜电位荧光强度下降,分别为 18.83+0.546%、14.15±0.804%、8.97+0.940%,与对照组(21.30+0.681%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)；④各浓度G-TOA导致HSC-T6细胞内游离钙荧光强度升高,分别为77.97±1.128%、91.13+3.763%、95.30+1.840%,与对照组(70.40+1.937%)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。3.形态学观察结果如下：①HE染色显示,对照组HSC-T6细胞生长旺盛,大小不等,连接致密,胞质淡红染,核型不规则。给药后细胞体积变小、部分细胞收缩变圆、核染色质边集、核固缩深染、或形成嗜酸性小体；②免疫细胞化学术显示：G-TOA作用HSC-T6细胞48小时后,NF-κB/p65、COX-2蛋白表达较对照组降低。4.Western Blot结果表明,与对照组相比,药物干预后HSC-T6的Bcl-2蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),bax蛋白表达没有明显的变化,Bcl-2/Bax的比例降低(P<0.05)。结论：先导化合物G-TOA具有四方面作用：①体外可以较明显抑制HSC-T6细胞增殖,对L02细胞低浓度促进增殖、高浓度(≥5μM)抑制细胞增殖；②对HSC-T6细胞周期无明显影响,明显诱导HSC-T6细胞凋亡,其机制可能与降低细胞线粒体膜电位、升高游离钙水平有关；③下调HSC-T6细胞NF-κB/p65、COX-2蛋白表达；④下调HSC-T6细胞Bcl-2蛋白表达,降低Bcl-2 /Bax的比值。G-TOA通过抑制HSC-T6细胞增殖、诱导HSC-T6细胞凋亡,防止肝星状细胞过度活化,起到抗肝纤维化的作用。