糖类（carbohydrate）是蛋白质、核酸之外,另一类关键的功能性生物分子。糖链及其与蛋白质、脂类组成的糖缀复合物具有重要的生理活性,同时也与病毒感染、癌症、细菌、寄生虫侵染等重大健康问题息息相关。活性糖链及糖缀复合物除了直接作为临床药物使用外,也在免疫治疗、疫苗开发等领域中发挥重要作用。其中,具备天然糖链结构特征的寡糖分子表现出良好药用开发潜力,成为构效关系研究、糖类药物开发的热点。目前,制备寡糖有两种途径,多糖降解途径和从头合成途径。后者又分为化学法合成和生物法合成。近几年来,利用重组工具酶分子模拟细胞内的过程在体外规模化制备结构均一的活性寡糖分子的技术体系取得了突破性进展。在糖基转移酶体外合成寡糖的方法中,供体绝大多数为尿苷二磷酸单糖（UDP-单糖）,其大量制备困难、成本昂贵。研究发现,植物细胞可以通过激酶将部分单糖分子催化成为1号位碳带有磷酸根的活化形式（单糖-1-磷酸,单糖-1-P）,然后在UTP提供能量的前提下单糖-1-P再由焦磷酸化酶转化成为UDP-单糖。因此,活性焦磷酸化酶的获得成为酶法制备UDP-单糖的前提条件之一。毕赤酵母表达系统（Pichia pastoris）的优势有:蛋白表达量高、杂蛋白少以及外源蛋白可胞外分泌。可作为重组制备拟南芥来源尿苷二磷酸单糖焦磷酸化酶（uridine diphosphate sugarpyrophosphorylase,USPase）的有效真核蛋白表达系统。本研究首次将拟南芥来源USPase的基因克隆到毕赤酵母表达载体中,实现该酶的有效分泌和高效表达。首先,分别将毕赤酵母密码子偏好性优化后的USPase基因置于组成型和甲醇诱导型启动子下游,构建获得USPase重组表达载体;通过一系列筛选过程,获得高拷贝整合转化子;通过活性检测筛选出高效胞外分泌USPase的重组酵母菌株;UDP-单糖酶法合成进一步确证重组USPase的活性。然后,对分泌表达USPase的重组毕赤酵母工程菌株摇瓶发酵培养基中的碳源、初始pH和反应温度分别进行了单因素优化,之后使用1L发酵罐完成了该重组菌株高密度发酵研究,并使用5L发酵罐验证了该条件的有效性。应用高密度发酵所得培养基上清中含有高活性USPase重组蛋白,实现了酶法合成UDP-葡萄糖（UDP-Glc）和UDP-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA）;并进行了 USPase在酶法合成UDP-Glc时最适反应条件的研究。本研究筛选获得了一株组成型分泌表达活性拟南芥USPase的高拷贝毕赤酵母重组菌株;通过单因素优化确定重组毕赤酵母工程菌株摇瓶发酵培养基中的最适碳源为葡萄糖,最适培养温度为30左右,最适初始pH为7.0左右,按照上述最优条件,摇瓶发酵产酶酶活可达到1703 U/mL;经过发酵条件优化,高密度发酵84 h时,培养基中USPase达到酶活最大值4312 U/mL。酶法合成UDP-Glc反应体系中USPase的反应最适pH为7.5左右,最适反应温度为37℃左右,最适金属离子为Mg2+。该重组工具酶分子的制备,为规模化制备UDP-Glc、UDP-GlcA等UDP-单糖奠定了基础。