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缺血缺氧/再灌注是指组织或器官在遭遇各种原因引起的血流中断氧气和能量等物质供应不足后,血流供应恢复时发生的比单纯缺血或缺氧更为严重的损害。这一损伤现象出现在多种病理状态中,包括心肌梗死,脑中风,急性肾衰竭和器官及干细胞移植手术过程中。缺血缺氧再灌注的分子病理机制涉及炎症因子,嗜中性粒细胞和反应活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的生成。其中,再灌注5分钟之内出现的由氧化应激引发的ROS的大量生成,被认为是再灌注损伤的早期事件并具有重要病理意义。在正常生理条件下,机体内的ROS被转录因子Nrf2(nuclear factor erythroid2(NFE2)-related factor2)调控的下游抗氧化还原基因网维持在正常水平。病理状态下,过量的ROS超出Nrf2下游靶基因的清除能力会攻击细胞内大分子物质如蛋白质,核苷酸和脂质等,触发线粒体DNA突变,诱导细胞凋亡,影响蛋白质生成等一系列严重的损伤。正常情况下,细胞内的Nrf2与其锚定蛋白Keap1(Kelch-like ECH associating protein1)结合滞留于细胞浆,由Keap1介导泛素化降解Nrf2蛋白。一旦ROS进攻Nrf2-Keap1复合物使Nrf2与Keap1解聚,Nrf2便由细胞浆转移至细胞核,并与其调控的下游靶基因启动子区的抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)结合。引起我们极大注意的是,PKC通路直接磷酸化Nrf2的40位丝氨酸位点是引起Nrf2与Keap1解聚引起核内转并触发下游靶基因转录的重要作用机制之一；PI3K通路也被鉴定为Nrf2活性的重要调节信号传导通路,但PI3K对其活化的作用机制尚不清楚。由复氧特异性激活的Nrf2核内转已经被多篇文章证实,但至今缺乏直接证据证明在缺血缺氧／再灌模型中增加Nrf2的活性可以提高细胞活力。由Nrf2转录调控的抗氧化作用的靶基因可以划分为几大类：1)Ⅱ相解毒酶,包含谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferases,GSTs),醌氧化还原酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase, NQO1)[18],血红素加氧酶(heme oxygenase-1, HO-1)[19],葡糖醛酸转移酶(UDP-glucuronyl transferase1A6, UGT1A6)等；2)非催化性抗氧化蛋白,例如硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)[20],谷氧还蛋白(glutaredoxin, Grx),过氧化蛋白(peroxiredoxin, Prx)[16]和金属硫蛋白(metallothioneins, MTs)等；3)谷胱甘肽合成限速酶,谷胱甘肽是体内重要的小分子抗氧化物,谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase, GCL)为其合成限速酶,由GCL催化亚基(GCLC)和调节亚基(GCLM)组成,这两种亚基均由Nrf2转录调控。由于Nrf2调控众多抗氧化应激蛋白,并且参与机体病理和生理条件下氧化还原平衡,因此最年来针对Nrf2的药品和治疗办法的专利研发成为治疗氧化应激类疾病的热门方向。阿片类受体属于7次跨膜的G偶联蛋白受体超家族,包含Mu (μ), kappa (K), delta (δ),和阿片样受体-1(ORL1)。这些受体与其体内的天然配体分别为内啡肽(endorphins),强啡肽(dynorphin),脑啡肽(enkephalin)和痛敏肽(nociceptin)结合后,激活胞浆面的抑制性G蛋白,通过各种信号传导通路触发下游分子机制。阿片受体广泛分布于中枢和外周神经系统,从18世纪开始便被应用于治疗与疼痛相关的疾病,至今在临床上仍被广泛应用。近年来的研究发现,除了治疗疼痛外,delta可片受体(delta opioid receptor, DOR)可以抵抗各类模型介导的神经元损伤,这些损伤包括谷氨酸(兴奋性),糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation, OGD),缺氧(hypoxia)和缺血(ischemia)而试验对象涉及原代培养的皮质神经元,脑片,或整体动物[23,241。此外DOR在迟发及快速低氧预处理介导的神经保护作用中起到枢纽作用。一方面,DOR介导的神经元保护作用在于稳定由缺血缺氧／再灌注损伤引发的离子稳态的改变,如抑制细胞膜上的Na+通道减少Na+内流,抑制细胞内Ca2+的过度聚集并减少了细胞内K+的过多漏出。另一方面,激动DOR减弱了氧化应激损伤,如增加了谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase),过氧化物歧化酶(superoxide dismutase)的活性,降低了丙二醛(malondialdehyde)和NO的水平。值得注意的是,蛋白激酶C(PKC)及细胞外信号调节激酶(extracellular signaling-regulated kinase,ERK)通路和PI3K/Akt通路[33,34]而非蛋白激酶A(PKA)通路是上述DOR发挥神经元保护作用的信号传导通路。这些研究表明DOR参与了与氧化应激有关的神经元保护机制,但以往对DOR的研究主要聚焦在神经元而几乎没有对星型胶质细胞的研究报道,并且这种保护作用的机制尚不完全清楚。由于PKC是最早被发现的DOR下游信号传导通路,而PKC能引起Nrf240位丝氨酸磷酸化触发核转移,并且DOR和Nrf2都参与了神经元的抗氧化应激,基于以上这些研究,我们提出假设,DOR是否通过触发Nrf2核转移引发下游抗氧化保护基因的表达在缺氧／再灌注模型中发挥保护作用。为证实这一假设,我们建立HEK293t细胞及原代培养大鼠皮层星型胶质细胞的缺氧再灌注模型,检测DOR及Nrf2对细胞的保护作用,使用DOR激动剂及拮抗剂研究DOR与Nrf2的相互关系。本研究取得的主要研究结果：1.在HEK293t细胞中,delta阿片受体激动剂UFP512可以引起Nrf2蛋白质进入细胞核,并增强Nrf2调控下游靶基因的功能；delta阿片受体的拮抗剂Naltrindole可以拮抗这种作用。2.PKC抑制剂calphostin可以抑制而PI3K抑制剂LY294002可以增强UFP512引起的Nrf2蛋白质细胞核内转。3.在HEK293t细胞缺氧再复氧损伤模型中,激动delta可片受体可以发挥细胞保护作用,这种保护作用在转染Nrf2siRNA后消失。4.在HEK293t细胞缺氧再复氧损伤模型中,delta可片受体激动剂UFP512可以引起Nrf2蛋白质进入细胞核,并增强Nrf2调控下游靶基因的功能；delta阿片受体的拮抗剂Naltrindole可以拮抗这种作用。5.在原代培养的Sprague-Dawley大鼠皮层星型胶质细胞缺氧再复氧模型中,激动delta阿片受体可以发挥细胞保护作用。在该模型中delta可片受体激动剂UFP512可以引起Nrf2蛋白质进入细胞核；delta阿片受体的拮抗剂Naltrindole可以拮抗由缺氧再复氧损伤引起的皮层星型胶质细胞的保护作用。6. Nrf2的诱导剂tBHQ引起delta阿片受体蛋白表达的增加,而对阿片受体的mRNA水平没有改变。综上所述,本课题首次查明了delta可片受体通过触发转录因子Nrf2的核转移,增加其下游氧化还原平衡基因的表达后在HEK293t细胞和原代培养的SD大鼠皮层星型胶质细胞缺氧再复氧模型中发挥细胞保护作用；明确了delta可片受体通过PKC信号传导通路引起Nrf2的核转移向。证实给予Nrf2激动剂引起DOR蛋白水平的增加但对其mRNA水平没有影响。总之,本研究提示增强氧化还原平衡转录因子Nrf2为delta可片受体帮助细胞抵御缺血性损伤的作用机制之一,并提示这种作用可能是通过PKC信号传导通路引起。