论文部分内容阅读
第一部分精子生殖源性ACE缺乏致常规体外受精中完全受精失败和低受精率目的：分析常规IVF中完全受精失败和低受精率的相关临床因素分析,了解精子gACE和ADAM2在体外受精中受精失败男性患者中的表达变化。材料和方法：1.收集本中心行常规IVF男性患者的剩余精子标本,加入冻存液-80℃冰箱保存。参照文献患者筛选标准为：①女方年龄≤38岁,②该周期获取正常成熟卵子数目≥3个,未成熟卵、畸形卵、过熟卵及存在某些其他异常类型的卵都剔除本研究,③男方精子标准为,精子总数>20×106并且前向运动精子活动率>20%。2.收集本中心行睾丸穿刺取精术或睾丸活检术患者的剩余睾丸组织标本,放置-80℃冰箱保存。其中唯支持细胞综合征患者10例,生精功能组织患者10例,正常生精功能患者10例。3.按照其受精情况将病例分为TFF组(40例患者)、LFR组(50例患者)和NFR组(50例患者)4.分析TFF组、LFR组及NFR组病例男女方年龄、不孕年限,获得成熟卵数、受精率、精子浓度、精子前向精子活动力及不育原因等临床一般资料数据。5.通过western blotting技术,检测不同生精状态的睾丸及正常形态精子gACE及ADAM2的表达情况。6.通过western blotting技术,检测TFF组、LFR组及NFR组病例精子gACE及ADAM2的表达水平。7.通过间接免疫荧光技术,检测gACE在人精子的表达情况,并检测TFF组、LFR组及NFR组病例精子gACE的表达水平。8.通过定量PCR技术,检测部分TFF组、LFR组及NFR组病例精子gACE及ADAM2的表达水平。9.观察精子在获能前、获能后及诱导发生顶体反应后gACE表达量的变化。结果：1.常规IVF中TFF组、LFR组及NFR组病例男女方患者的年龄、不孕年限及获成熟卵数均无显著性差异。2.常规IVF中TFF组、LFR组及NFR组病例获卵当日精液质量常规参数比较,其精子浓度及前向运动精子活动力呈显著性差异。TFF组及LFR组病例的精子浓度及前向运动精子活动力均低于对照组NFR组。但TFF组及LFR组病例之间的精子浓度及前向运动精子活动力无显著性差异。3.常规IVF中TFF组、LFR组不明原因性不育及原发不育比例高于NFR组。4. sACE在唯支持细胞综合征、生精功能障碍及正常生精功能的患者睾丸中表达,但是在精子不表达。5. gACE在正常生精功能的患者睾丸中表达,但在唯支持细胞综合征及生精功能障碍的患者睾丸中不表达。6. gACE表达于人精子中顶体后区、颈部及中段。7.常规IVF中TFF组、LFR组及NFR组三组之间gACE蛋白相对表达量呈显著性差异。与对照组NFR组比较,TFF组及LFR组患者的gACE蛋白相对表达量均低于NFR组。但是TFF组及LFR组患者之间的gACE蛋白相对表达量无显著性差异8. gACE蛋白表达水平在37.5%(15/40)的TFF组及20%(10/50)的LFR组病例精子表达水平下调。9.在原发不育患者中,gACE蛋白表达水平在53.8%(15/28)的TFF组患者及45.5%(10/22)的LFR组患者中下调。10.ADAM2表达水平常规IVF中TFF组、LFR组及NFR组病例精子中表达水平无显著性差异。11.钙离子载体A23157诱导精子发生顶体反应。获能前、获能后及A23157诱导后gACE蛋白表达水平无显著性差异。结论：1.常规IVF中完全受精失败和低受精率与获卵当日精子浓度及前向精子活动力相关。2.原发不育及不明原因性不育患者行常规IVF时存在完全受精失败和低受精率高风险。3.男性精子gACE的正常表达是受精过程完成的关键条件。第二部分精子生殖源性ACE缺乏致常规体外受精中完全受精失败和低受精率的机制研究目的：观察筛选gACE特异调控区域及全部外显子DNA序列是否发生变化。分析发现的gACE SNP位点与患者受精失败之间的相关性。验证该基因SNP位点对gACE转录水平的影响。方法：1.收集本中心行常规IVF男性患者的剩余精子标本,加入冻存液-80℃冰箱保存。参照文献患者筛选标准为：①女方年龄≤38岁,②该周期获取正常成熟卵子数目≥3个,未成熟卵、畸形卵、过熟卵及存在某些其他异常类型的卵都剔除本研究,③男方精子标准为,精子总数>20×106并且前向运动精子活动率>20%。2.按照其受精情况将病例分为TFF组(40例患者)、LFR组(50例患者)和NFR组(50例患者)。3.PCR扩增和测序方法筛选gACE低表达患者其基因特异调控区域DNA序列是否发生变化。4.设计PCR-RFLP方法检测发现的SNP位点,并检测SNP位点在常规IVF男性患者的分布情况。5.利用双荧光素酶报告基因检测系统验证SNP位点对gACE的转录水平影响。6.PCR扩增和测序方法筛选gACE全部外显子DNA序列是否发生变化。结果：1.92%gACE表达下降患者(23/25)SNP rs4316的基因型为TT, SNP rs4320的基因型为aa。2.rs4316等位基因T的频率与rs4320等位基因a的频率呈连锁相关。3.与NFR组比较,TFF组及LFR组中rs4316的TT基因型没有显著性升高,但是TFF组与LFR组整合后比较,其TT基因型高于NFR组。4.LFR组中rs4316等位基因T的频率高于NFR组。5.双荧光素酶报告质粒共转染,SNP rs4316T等位基因与C等位基因相比,可下调荧光素酶的活性。6.一完全受精失败患者检测到gACE新的杂合子突变(pSer1005Cys)。结论：1.rs4316等位基因T及rs4320等位基因a与受精失败相关。2. SNP rs4316的TT基因型及SNP rs4320的aa基因型可能与gACE表达下降有关。