过氧化酶体激活物增殖受体(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)属于配体激活的转录因子，目前己发现三种亚型：PPARα、PPAR γ和PPARδ。PPAR γ在脂肪组织中表达较高，在乳腺、结肠、肺、卵巢等其它组织中也有不同程度的表达。研究结果表明PPARγ激活后除了可促进脂肪形成及发挥抗炎作用外，还可抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其分化并促进凋亡、对其侵袭转移也有一定的抑制作用。 噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZDs)是一类具有强烈PPAR γ激动活性的化合物，其中以罗格列酮(Rosiglitazone，ROZ)的活性最强，可达纳摩尔水平。GLPO2则为一新合成的化合物，也属于PPAR γ激动剂，由我所合成室郭宗儒教授课题组提供。在该部分研究中，将主要探讨ROZ和GLPO2对结肠癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞株的抗肿瘤作用及相关机制。 1．对人结肠癌HT-29细胞的抗肿瘤作用 ROZ和GLPO2均可明显抑制HT-29细胞的生长及集落形成，后者的抑制作用明显强于前者。两者均可抑制HT-29细胞DNA和蛋白质的合成，对后者的抑制尤为显著。 ROZ和GLPO2可减少G1期细胞比例，而增加G2期和S期细胞的比例。HT-29细胞经两化合物处理72h后可出现明显的DNA梯状条带(DNA Ladder)，ROZ处理细胞后，凋亡细胞所占比例明显升高， Western Blot结果显示，ROZ和GLPO2可明显降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。 RT-PCR、Westem Blot和免疫组化的结果显示，ROZ可促进HT-29细胞PPARγ的表达，并呈剂量依赖性；GLPO2在低剂量时即可明显提高PPAR γ的表达，而增加剂量后反而抑制其表达。 ROZ不影响ERK1／2的表达，但可以明显促进p-ERK的表达，推测ROZ可能是通过促进ERK磷酸化而增加PPAR γ磷酸化水平，从而导致PPAR γ活性降低，影响细胞增殖并诱导凋亡。与ROZ不同，GLPO<,2>可明显降低ERK1／2和p-ERK的表达，推测该化合物可能是通过抑制ERK1／2及其磷酸化，而发挥抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。 与体外研究结果一致，裸鼠实验结果显示ROZ和GLPO<,2>均可使肿瘤组织发生明显纤维化，抑制裸HT-29异体移植瘤的生长，GLPO<,2>的抑制效果强于ROZ。 相关研究报道显示PPARy和类视黄醇x受体(retinoid X receptor，RXR)两者只有在组成异二聚体同时活化时才能充分发挥作用，其中任一受体单独激活都不足以完全抑制肿瘤细胞的增殖。故本研究将PPARy激动剂ROZ与RXR激动剂全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)同时应用，观察后者是否可增强ROZ对HT-29细胞的抑制作用，以期为结肠癌的治疗提供实验依据。 2．ROZ和ATRA联合应用在人结肠癌HT-29的抗肿瘤作用 两者联合应用的结果显示，ATRA可明显增强ROZ对HT-29的生长抑制作用，提高其诱导细胞凋亡的能力。在两者单独使用均不引起细胞凋亡的剂量下联合使用，可使HT-29细胞的凋亡比例达到37.9％和60-6％。单独使用ATRA对Bc1-2的表达无影响，ROZ则可降低Bc1-2的表达，并呈剂量依赖性，两者联合应用后降低HT-29细胞Bc1-2表达的作用显著增强。 ROZ和ATRA单独应用时仅轻微升高HT-29细胞中碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)的活性，而联合使用对AKP活性的影响明显增强。提示两者联合使用可促进HT-29细胞的分化。 HT-29细胞分别经ROZ和ATRA单独作用以及两者联合作用后接种于裸鼠体内，ATRA单独作用后形成的肿瘤其大小与对照组相比无明显差别，ROZ作用后形成的肿瘤体积约为对照组的一半，而两者联合处理后形成的肿瘤明显缩小，仅为对照组的10％左右。 ROZ和ATRA联合作用于HT-29细胞后，其G1期细胞降低的比例较单药更为明显，G2期细胞下降的比例也很明显，而S期的比例则呈上升趋势。 ROZ对ERK的表达没有明显影响，但联合应用ATRA后，ERK的表达明显增加，同时，ROZ还可增加ERK的磷酸化水平，联合应用ATRA后，p-ERK的表达在ROZ低剂量时升高，高剂量时抑制。 3.对乳腺癌的抗肿瘤作用 ROZ和GLP02对MCF-7细胞的生长均有明显地抑制作用，可抑制其DNA的合成，GLP02的作用强于ROZ。ROZ和GLP02可引起少部分细胞发生凋亡，对凋亡相关蛋白Bcl-2的表达也具有一定的降低作用，同样GLP02的作用略强于ROZ。 细胞周期分析结果显示，ROZ可以升高G1+G2期细胞比例，同时降低S期细胞的比例。GLP02对G1期细胞比例无明显影响，增加G2期+S期细胞的比例。 ROZ使MCF-7细胞中的PPAR γ表达升高，而GLP02使其剂量依赖性地降低。 对蛋白P53的分析结果显示，ROZ和GLP02对P53的表达均有增强作用。 两化合物在低于诱导细胞凋亡的剂量下可诱导细胞成衰老样表型，维持细胞衰老状态。 体内裸鼠移植瘤实验结果与体外实验结果一致，ROZ可以明显抑制MCF-7裸鼠移植瘤的生长，作用强度与阿霉素相当，而且对裸鼠体重无明显影响。 4.对黑色素瘤的抗肿瘤作用 综上所述，ROZ和GLPO2可能是通过诱导分化，促进凋亡以及抗侵袭转移等多种机制而发挥其抗肿瘤作用，该类化合物有望成为新型的抗肿瘤药物。 PPAR γ与肿瘤的关系还未完全清楚阐明，存在着诸多矛盾的结论，究其原因可能是PPAR γ作用范围广泛，作用机制复杂，影响PPAR γ发挥作用的影响因素多，并且受PPAR γ调控的靶基因多且复杂，相互之间亦存在交互作用。乳腺癌与PPAR r的表达尤为密切，因此在本研究中，为了比较PPAR γ在正常细胞与肿瘤细胞之间、在乳腺癌细胞雌激素受体阳性和受体阴性细胞之间作用的联系与差异，初步探讨PPAR γ基因在抗肿瘤作用中的功能及可能的信号传导途径，将hPPAR γ2基因转染入NIH3T3、MCF-7、MDA-MB-231细胞，经过鉴定筛选出稳定高表达的转基因细胞株。 研究中发现转入hPPAR γ2基因后，三株细胞中PPAR γ的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均明显升高。对于未转入基因的细胞，ROZ均增高原有：PPAR γ的表达，对于转基因的细胞，ROZ同样升高NIH3T3细胞中PPAR γ表达，而降低MDA-MB-231中PPAR γ的表达，对于MCF-7细胞则是低剂量时增高，高剂量时抑制，而这也正与诱导分化的结果一致。 1．NIH3T3细胞与Pγ2-NIH3T3细胞 2.MDA-MB-231细胞与Py2-MDA-MB-231细胞 3．MCF-7细胞与Pγ2-MCF-7细胞 综上所述，转入hPPARγ2基因后可使细胞形态改变，致瘤性增强、细胞粘附能力降低，运动功能增强，肿瘤细胞分化能力降低、侵袭转移能力增加，而且hPPARγ2主要影响MAPK通路、一些生长因子的通路(如TGFβ、IGFl、EGFR)以及激素水平和周期凋亡相关的蛋白，反过来，MAPK及其它生长因子及激素也影响hPPARγ2的表达。因此可以认为hPPARγ2基因有可能成为肿瘤治疗和诊断的一个靶点，而其激动剂有望成为治疗肿瘤或者辅助治疗肿瘤的一类新药。 首先，利用论文第二部分建立的pMD18-T／hPPARγ2亚克隆扩增出hPPARγ2前1017bp cDNA。利用pET原核表达系统表达了含有hPPAR72前339个氨基酸(C-Histag)融合蛋白，并成功地进行了纯化。 其次利用原核表达的重组hPPARγ2蛋白制备了特异性抗hPPARγ2单克隆抗体1B4，3H2，3H10，10D6和10D8。通过ELISA和Western Blot方法对抗体进行了特异性鉴定。证明这5株单抗均为hPPARγ2的特异性抗体。 综上所述，这些系统的建立和鼠源抗hPPARγ2单克隆抗体的制备为后续的针对hPPART2抗肿瘤作用及机制研究提供了良好的工具，同时为细胞水平高通量筛选模型的建立奠定了基础，节约了成本。