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食管癌是世界高发的恶性肿瘤之一。其起病隐匿,进展迅速的特征,使多数患者发现时已为晚期,预后差。食管癌患者的预后和早期诊断有着密切关系,但由于缺乏有效的早期诊断手段,大部分患者首诊时已为进展期,其五年生存率在15%~25%之间。随着转化医学的发展,寻找特异性肿瘤标记物是早期诊断的关键,为手术根治提供机会。分子靶向治疗是继手术治疗、放疗、化疗之后肿瘤患者的又一选择,也为食管癌合理化、个体化的诊治提供了新的研究方向。因此,有必要深入探索有应用价值的食管癌分子标志物和靶分子,从而为提高食管癌的早诊率和发展个体化治疗奠定实验基础。NOB1编码蛋白,含有一个PIN结构域及一个锌带蛋白结构域,其通过调节转录途径,在细胞周期、肿瘤发生及进展、多药耐药等生物过程中扮演重要角色。近期部分研究者的RT-PCR相关实验结果显示,NOB1在人体的食管、肺、肝、脾、结肠、肾等多种组织中均都有不同程度的表达,其中,已有研究发现,NOB1可能与乳腺癌、白血病、结肠癌、肝癌、甲状腺腺癌、宫颈癌、卵巢癌、胶质瘤等疾病的发生相关。本研究拟为检测NOB1在食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达情况,并观察其在不同分期、分级的食管癌组织中的表达水平,探讨NOB1蛋白对食管癌细胞生长和耐药性的调控作用,从而分析NOB1在食管癌中发生、发展的作用,进而探讨NOB1蛋白在早期诊断食管癌及治疗中的作用,旨在为探索新的基因诊疗方法奠定基础。【目的】1.观察NOB1在食管鳞状细胞癌中的表达情况,进而分析其表达水平与临床病理特征的相关性;2.随访术后患者,分析NOB1的表达与患者预后的关系;3.测定食管癌细胞系及食管正常上皮细胞系中NOB1蛋白的表达水平;4.观察NOB1 m RNA在食管癌细胞系中的表达情况;5.构建低表达NOB1的食管癌细胞系;6.探讨NOB1蛋白对食管癌细胞生长的调控作用;7.探讨NOB1蛋白对食管癌细胞耐药性的调控作用。【方法】1.收集我院食管癌术后标本,制作癌组织、癌旁组织病理切片;2.利用免疫组织化SP法检测NOB1在食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织中的表达情况;3.在电子病历系统中建立术后患者随访表,电话追踪患者术后情况;4.应用免疫印迹法测定食管癌细胞系及食管正常上皮细胞系中NOB1蛋白的表达水平;5.应用荧光实时定量PCR测定NOB1 m RNA在食管癌细胞系中表达情况;6.利用慢病毒转染技术构建低表达NOB1的食管癌细胞系;7.利用MTT实验和平板克隆形成实验探讨NOB1对食管癌细胞生长的调控作用;8.利用MTT实验、流式细胞仪技术和Annexin/PI染色法研究NOB1对食管癌细胞耐药性的调控作用;9.用Student’s t检验、Pearsonχ2检验或者Fisher’s精确检验分析NOB1在食管鳞状细胞癌的表达与患者年龄、性别、肿瘤分级、浸润深度、淋巴结转移等的相关性;10.相关数据用SPSS 16.0统计软件进行统计与分析,生存分析用Kaplan-Meier生存曲线、log-rank检验进行统计,预后分析用COX回归模型进行统计,其中,P<0.05认定为差异有统计学意义。【结果】1.164例食管鳞状细胞癌的癌组织中,NOB1蛋白在细胞质中弥漫表达;2.免疫组化结果显示,在164例食管癌组织中,NOB1在49例(29.9%)呈强阳性表达(++),在52例(31.7%)呈阳性表达(+),在63例(38.4%)呈阴性表达(-)。NOB1蛋白在101例(61.5%)食管癌组织中的表达高于癌旁组织。3.在8例食管癌患者新鲜的癌组织与癌旁组织中,运用PCR的方法检测到NOB1m RNA的表达,发现NOB1在癌组织里面高表达(0.9±0.023),而在癌旁组织中呈低表达(0.3±0.004)。4.NOB1的表达水平与肿瘤的大小、分化程度有关,与年龄、性别、淋巴结转移等无关。5.发现NOB1强阳性表达患者的生存期明显较低表达者短(P=0.016),预后更差;统计数据表明,随着NOB1表达强度的增加,食管癌患者的预后变得越来越差。6.Western-blot结果显示:与正常食管上皮HEEC相比,NOB1蛋白在食管癌细胞系EC109和EC9706中高表达。7.实时定量PCR结果显示:NOB1 m RNA在食管癌细胞系中高表达,其表达水平与western-blot的结果趋势基本上保持一致。8.通过慢病毒转染抑制了NOB1在食管癌细胞中的表达,发现下调NOB1可以显著抑制食管癌细胞EC9706的增殖能力。9.下调NOB1可以显著抑制食管癌细胞EC9706的耐药性。【结论】1.NOB1在食管鳞状细胞癌中的表达明显升高,其表达水平与食管癌的分化程度密切相关;NOB1的表达越强,患者的预后越差;2.下调NOB1可以显著抑制食管癌细胞的增殖能力和耐药性;3.NOB1是一个有应用价值的食管鳞状细胞癌的预后相关分子,还是一个潜在的基因治疗靶点。