精子发生是一个独特、复杂的细胞分化过程,受到多种因素的精密调控。支持细胞作为唯一与各级生殖细胞紧密接触的体细胞,通过影响睾丸发育和形成,以及为生殖细胞提供环境效应、营养和支持作用在此过程中发挥核心作用。此外,还有研究指出,在精子发生过程中,支持细胞经历了由增殖、分化转化为成熟支持细胞的过程,未成熟支持细胞增殖活性直接影响支持细胞数量,成熟睾丸中支持细胞的数量直接决定睾丸大小和日精子产生量。Micro RNA（miRNA）是一类长约22 nt的非编码小RNA,广泛存在于各种生物中,调节生物体生长、发育和凋亡等过程。诸多研究表明,多种miRNA特异性表达于哺乳动物睾丸中参与调控精子发生及睾丸发育等过程。因此,进一步研究miRNA在睾丸支持细胞增殖和凋亡过程中的作用及机制对解析支持细胞调控机制与精子发生,提高精液品质及促进畜牧业高质量发展具有重要的理论与实践意义。通过sRNA-seq分析,我们在不同发育阶段牛睾丸组织中检测到Bta-miR-34b（miR-34b）的差异表达,推测miR-34b可通过调控牛未成熟睾丸支持细胞的生长进而调控精子发生过程。因此,本研究以牛未成熟睾丸支持细胞为研究对象,通过合成miR-34b模拟物与抑制物转染未成熟支持细胞研究miR-34b对牛睾丸支持细胞增殖与凋亡的影响;通过RNA-seq与生物信息学方法筛选miR-34b的靶基因,并通过克隆靶基因3’非编码区（3’UTR）和转录后调控探讨miR-34b对靶基因表达的调控机制;最后利用RNA干扰和过表达技术探讨靶基因对牛睾丸支持细胞增殖与凋亡的调控作用。研究结果如下:1.miRNA-34b对牛睾丸支持细胞增殖与凋亡的影响miR-34b过表达可显著抑制牛睾丸支持细胞的增殖,将支持细胞阻滞在G2期,并引起增殖相关基因（CCNB1、CDK1、C-MYC、CDC25C）m RNA的表达下降,CCNB1和CDK1的蛋白水平下降。过表达miR-34b还可促进细胞凋亡,导致促凋亡相关基因P53和BAX的转录水平显著上升,而BCL2/BAX比值在m RNA和蛋白水平均显著下降。抑制miR-34b的表达可促进细胞增殖,减少G2期细胞分布,抑制细胞凋亡。说明,miR-34b可通过抑制细胞周期进程,并促进其凋亡来影响支持细胞生长。2.miR-34b靶基因的预测及鉴定运用RNA-seq和生物信息学预测等方法筛选miR-34b的靶基因。RNA-seq结果表明,相比于对照组,过表达miR-34b引起318个基因的表达变化,其中193个基因显著上调,125个基因显著下调。结合生物信息学软件Target Scan分析预测的靶基因,发现有22个显著下调基因和4个上调基因重合。之后结合KEGG通路分析,筛选出MAP2K1为miR-34b靶基因,并用于后续研究。q PCR与Western blotting结果表明,miR-34b mimic处理显著抑制MAP2K1的表达,而转染miR-34b inhibitor,MAP2K1的表达量上升。双荧光素酶报告实验表明,miR-34b可靶向结合MAP2K1 3’UTR预测结合位点,引起MAP2K1-3’UTR WT组荧光素酶活性显著降低,而结合位点的突变可抑制miR-34b的结合。此外,miR-34b处理降低MAP2K1下游通路ERK1/2的磷酸化水平,而miR-34b inhibitor处理促进ERK1/2的磷酸化水平上升。表明,MAP2K1为miR-34b的靶基因。3.MAP2K1对牛睾丸支持细胞增殖与凋亡的影响与miR-34b mimic处理结果一致,干扰MAP2K1的表达抑制牛睾丸支持细胞的增殖,将支持细胞阻滞在G2期,并引起增殖相关基因（CCNB1、CDK1、C-MYC、CDC25C）m RNA的表达下降,CCNB1和CDK1的蛋白水平下降。MAP2K1表达量的下降还可促进细胞凋亡,引起促凋亡相关基因P53和BAX的转录水平显著上升,而BCL2/BAX比值在m RNA和蛋白水平均显著下降。此外,MAP2K1的抑制还可导致ERK1/2磷酸化水平下降。在MAP2K1过表达实验中,MAP2K1的过表达显著减轻miR-34b mimic对牛睾丸支持细胞增殖的抑制,使细胞在G2期的分布减少,并引起增殖相关基因（CCNB1、CDK1、C-MYC、CDC25C）m RNA的表达上升,CCNB1和CDK1的蛋白水平表达上升。过表达MAP2K1还可抑制miR-34b mimic处理引起的细胞凋亡,抑制促凋亡基因P53的表达,促进抑凋亡基因BCL2的表达,并引起BCL2/BAX比值在m RNA和蛋白水平均显著上升。此外,MAP2K1的过表达还可促进ERK1/2磷酸化水平上升。综上所述,miR-34b可通过靶向MAP2K1介导的MEK/ERK通路抑制未成年牛睾丸支持细胞增殖并促进其凋亡。