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无机砷(iAs)甲基化是砷在动物体内的主要代谢途径,被公认为砷元素的解毒过程。砷甲基化酶(AS3MT)被确认为iAsIII甲基化过程中的生物酶。本文以重组人砷甲基化酶(hAS3MT)及其催化的iAsIII甲基化为研究对象进行实验。运用酶动力学、正交初速度实验、光谱学、HPLC-ICP-MS等系统研究了hAS3MT中半光氨酸(Cys)残基的作用；探讨了hAS3MT的催化机制；进一步系统研究了硒及过渡金属离子对hAS3MT催化的iAsIII甲基化的影响,初步推测了硒及过渡金属离子的抑制机制。主要工作如下：(1)采用改进的重叠PCR及大引物PCR定点诱变方法以pET-32a-hAS3MT质粒中hAS3MT cDNA编码区为模板设计突变体引物。通过PCR技术以pET-32a-hAS3MT为模板将Cys72、Cys271、Cys334、Cys360及Cys375分别突变成丝氨酸。采用双脱氧法测序检验各突变体DNA序列的正确性。以E. coli BL21(DE3)pLysS为宿主菌,IPTG氐温诱导进行突变体蛋白的表达,经Ni-NTA His-bind resin亲和柱纯化,获得了hAS3MT的五个突变体酶。系统研究了突变体酶的催化活性、动力学、热稳定性、二级结构、并研究了硒对其活性的影响。研究结果表明突变体C72S完全失去了催化iAsIII甲基化的活性,其二级结构也有较大的变化,结合以前的研究结果推测Cys72可能与Cys250之间形成了二硫键。Cys271、Cys375不影响hAS3MT的活性和结构。然而,Cys334和Cys360的突变降低了酶的转化率,也在一定程度上改变了hAS3MT的构像。动力学数据表明Cys271、Cys334、Cys360以及Cys375不结合甲基供体(SAM),但可以结合底物砷(iAsIII)以及抑制剂硒(SeIV)。另外除了Cys375,其它的Cys残基都能够在一定程度上影响hAS3MT的热稳定性。(2)采用IPTG低温诱导进行蛋白表达,经Ni-NTA His·bind resin亲和柱纯化获得了重组hAS3MT。通过动力学、初速度、光谱学等研究了hAS3MT的催化机制。结果表明hAS3MT催化的iAsIII甲基化是一个多步、按次序进行的反应。甲基化砷(一甲基化砷(MMA)、二甲基化砷(DMA))的含量及形态分布随着酶含量、底物iAsIiI浓度、SAM浓度、硫醇浓度、pH及孵育时间的变化而改变。这说明iAsIll的甲基化及MMAⅢ的甲基化之间存在竞争性。在GSH作为还原剂的条件下,hAS3MT的活性在pH8.5时达到最高。hAS3MT的活性中心为含有巯基的Cys156和Cys206。一般认为Cys残基中巯基的pKa约为8.3。pH8.5的弱碱性环境有利于巯基去质子化及质子化之间的循环平衡从而促进反应的进行,使hAS3MT的反应活性达到最高。通过固定一种反应物的不同浓度改变另一种反应物的浓度,而其它反应物浓度不变的条件下进行iAsⅢ甲基化反应初速度的研究。根据酶学研究,结果表明SAM、iAsⅢ和hAS3MT的结合是按先后次序进行的；而GSH或作为反应流程中的第一个反应物,或者在一个或多个产物从酶上释放下来之后再与hAS3MT结合。通过紫外光谱、圆二色光谱我们第一次研究了底物iAsIII及辅因子与hAS3MT之间的相互作用。结果表明iAsIII和SAM在反应开始之前与hAS3MT结合；而GSH在反应开始前不与hAS3MT结合。综合动力学、初速度和光谱学的研究结果,我们推测iAsⅢ、SAM与hAS3MT的结合是有序的机制且SAM先于iAsIII,iAsIII的甲基化过程是连续甲基化机制而不是氧化甲基化机制,这与Hayawaba课题组所提出的机制在本质上是一致的。然而在我们的机制中,iAsIII不需要以砷-硫化合物(As-thiol)的形式作为底物进行甲基化。GSH应该在甲基化反应结束产物从酶上释放之后再与hAS3MT作用,还原hAS3MT活性位点在催化过程中形成的二硫键以恢复hAS3MT的活性状态。(3)由于iAs能够引起肝癌、溶血、脊髓压迫、血管增厚等疾病。因此我们选择了分别在上述器官或组织中相对含量较高的CoIl、ZnII、MnII、FeIl等金属元素研究它们对hAS3MT催化的iAsIII甲基化的影响。同时进一步研究SeIV及金属离子抑制iAsIII甲基化的作用机制并通过紫外光谱、圆二色光谱和荧光光谱研究上述金属离子与hAS3MT之间的相互作用。结果发现CoIl、MnII、ZnII、FeII都能够抑制iAsIIl的甲基化。抑制动力学表明CoII、MnII。类似于混合性(竞争性与非竞争性)抑制剂而ZnII是竞争性抑制剂。然而只有高浓度的FelI才能够抑制iAsIII的甲基化。CoⅡ、MnⅡ、ZnⅡ都能够与hAS3MT发生相互作用影响酶的结构。除氧剂实验表明在CoⅡ、MnⅡ、ZnⅡ及SeⅣ抑制iAsⅢ甲基化的过程中没有活性氧的参与。二硫代苏糖醇(DTT)可以恢复SeⅣ对iAsⅢ甲基化的抑制作用,而半胱氨酸(CySH)和巯基乙醇(ME)不能。DTT和CySH都能够恢复CoⅡ、MnⅡ及ZnⅡ。对iAsⅢ甲基化的抑制作用,而ME不能。综合以上实验结果推测金属离子及SeⅣ与hAS3MT中关键氨基酸残基(包含Cys残基)作用生成加合物从而起到抑制作用。SeⅣ和ZnⅡ对hAS3MT活性的抑制作用是通过RS-Zn/Se-SR形式。而COⅡ和MnⅡ,除RS-Co/Mn-SR形式外还可能催化了hAS3MT中二硫键的形成。