目的：　　 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,内分泌治疗和分子靶向治疗是乳腺癌的两个重要治疗手段。他莫昔芬(tamoxifen,TAM)是雌激素受体拮抗剂,是乳腺癌内分泌治疗的一线用药,肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是一种具有潜在林床应用价值的靶向生物制剂(Ⅱ期临床试验阶段)。临床上大部分患者在应用TAM一段时间后发生继发耐药,大部分乳腺癌细胞对TRAIL原发性耐药。研究TAM及TRAIL的耐药机制,探索逆转耐药的新措施可为乳腺癌的内分泌及分子靶向治疗提供理论依据。　　 TAM主要通过竞争性与雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合,从而拮抗雌激素,抑制ER阳性乳腺癌细胞增殖。研究发现乳腺癌细胞对内分泌治疗药物的敏感性与细胞存活通路的活性密切相关,HER-2等细胞膜生长因子受体过表达后可通过活化细胞内的存活通路导致细胞对TAM耐药,抑制细胞内存活通路的活性可增强乳腺癌细胞对TAM的敏感性。最近研究发现TAM可以通过ER非依赖的途径诱导ER阳性及阴性的肿瘤细胞凋亡,但是TAM诱导乳腺癌细胞凋亡过程中细胞存活通路所发挥的作用尚不明确。本课题的第一部分将主要研究细胞存活通路在TAM诱导乳腺癌细胞凋亡过程中所发挥的作用。　　 TRAIL通过与细胞膜上的死亡受体4(death receptor,DR)和死亡受体5(DR5)结合导致死亡受体通路起始因子Caspase-8的活化,最终导致死亡底物PARP等的裂解,诱导细胞凋亡。既往研究发现乳腺癌细胞DR4/DR5的表达普遍较低或缺失,副作用较大的化疗药物,如表阿霉素、紫杉醇、顺铂等可通过上调死亡受体的表达增强肿瘤细胞对TRAIL的敏感性,但是副作用比较小的中药增强乳腺癌细胞对TRAIL敏感性影响的报道尚少。本课题第二部分选择传统中药蟾酥的有效成分蟾蜍灵(Bufalin),研究其对DR4/DR5的表达及乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性的影响。　　 泛素蛋白酶体途径是真核细胞内选择性降解蛋白质的重要途径。c-Cb1和Cb1-b是Cb1家族研究比较广泛的E3泛素连接酶,它们可以通过特异性选择底物蛋白启动泛素化降解途径,参与膜受体表达及细胞内信号通路活性的负性调节。本课题以乳腺癌细胞MCF-7细胞为模型,研究Cb1家族对细胞存活通路活性及TAM敏感性的调节,以MCF-7和MDA-MB-231为模型研究Cb1家族对死亡受体表达的调节及对TRAIL敏感性的调控。　　 材料与方法：　　 1.采用MTT法检测细胞活力,绘制细胞增殖曲线。　　 2.采用流式细胞仪检测细胞膜表面DR4/DR5的表达,PI单染法进行细胞周期分析、凋亡判定。　　 3.采用Western blot检测c-Cbl、Cbl-b、ERK、AKT、JNK、p38、DR4、DR5等蛋白的表达。　　 4.采用RT-PCR方法检测DR4/DR5的mRNA表达水平。　　 5.采用LipofectaminTAM 2000试剂进行瞬时转染。　　 6.统计学处理:每个实验重复3次,数据以均值±标准差(-x±s)表示,两组间差异采用t检验,P＜0.05有统计学意义。　　 实验结果：　　 1、TAM抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖诱导细胞发生凋亡　　 TAM以时间和剂量依赖的方式抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,24h、48h细胞增殖抑制率达50%的药物浓度(IC50)分别为23.6±1.2μM和14.4±1.1μM。流式分析显示5μM的TAM作用于MCF-7细胞24h后仅有4.1%的细胞凋亡,25μM的TAM作用于MCF-7细胞16h和24h后,分别有10.2%和20.1%的细胞凋亡,提示TAM以时间及剂量依赖方式诱导MCF-7细胞凋亡。　　 2、TAM对细胞存活信号活性的影响及细胞存活信号在细胞凋亡过程中发挥的作用。　　 以诱导MCF-7发生明显凋亡的TAM浓度(25μM)作用于细胞不同时间后检测c-Src、Akt、ERK的表达及活性的变化。Western blot分析结果显示MCF-7细胞内有一定程度的基础c-Src活性,在TAM作用16h和24h后c-Src的活性被抑制,表达水平被下调。TAM可诱导ERK的快速且持续的活化。TAM作用3h后AKT出现活化,24h后降至基础水平以下。分别用10μM的PP2(c-Src特异性抑制剂),20μM的PD98059(ERK特异性抑制剂),10μM的LY294002(AKT特异性抑制剂)预处理1h后,给予25μM的TAM作用24h,流式分析显示,细胞的凋亡由20.1%分别上升至40.67%、45.88%和51.4%,提示c-Src、ERK和AKT在TAM诱导凋亡过程中发挥了保护性作用。　　 3、乳腺癌细胞对靶向药物TRAIL的敏感性及Bufalin对TRAIL敏感性的影响　　 在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,100ng/mL的TRAIL诱导＜7%的细胞凋亡。MTT结果显示Bufalin以时间和剂量依赖的方式抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖,MCF-7细胞24h和48h的IC50分别是317.9±1.5nM和46.5±1.4nM,MDA-MB-231细胞24h和48h的IC50分别是934.1±2.0nM和513.3±1.6nM,结果提示MCF-7细胞比MDA-MB-231细胞对Bufalin的敏感性高,因此我们选择MCF-7细胞48h的IC50附近浓度(50nM)检测Bufalin对TRAIL诱导凋亡的影响。流式分析结果显示50nM的Bufalin作用24h主要诱导细胞发生G2M期阻滞,仅诱导4～10%的细胞发生凋亡。Bufalin与TRAIL联合作用24h可诱导30.1%的MCF-7细胞凋亡,41.5%的MDA-MB-231细胞凋亡,提示虽然不同的乳腺癌细胞系对Bufalin敏感性差异很大,但是低浓度的Bufalin均可增强它们对TRAIL诱导凋亡的敏感性。　　 4、死亡受体表达的上调介导了Bufalin对TRAIL的增敏作用　　 为明确Bufalin增强TRAIL诱导细胞凋亡的机制,我们检测了两药联合作用后死亡受体凋亡通路活性的变化情况。Western blot分析结果显示,两药联合作用后可明显活化死亡受体凋亡通路的启动因子Caspase-8及死亡底物PARP。进一步研究发现,Bufalin作用后可在MCF-7和MDA-MB-231细胞中上调DR4和DR5蛋白及mRNA。采用siRNA抑制Bufalin对DR4和DR5的上调后,部分逆转了Bufalin与TRAIL诱导的凋亡,结果提示DR4和DR5的上调,部分介导了Bufalin增强TRAIL敏感性的过程。　　 5、死亡受体表达的调控机制　　 为研究Bufalin上调死亡受体DR4/DR5的机制,我们在MDA-MB-231细胞上检测了Bufalin作用后ERK、JNK、p38活性的变化。Western blot分析结果显示,Bufalin可诱导ERK、JNK和p38的活化。分别用ERK、JNK和p38特异性的抑制剂预处理2.5h后给予Bufalin,结果DR4/DR5的上调被逆转,同时Bufalin和TRAIL诱导的凋亡也被部分逆转,结果提示ERK、JNK和p38的活化导致了DR4/DR5的上调。　　 6、Cb1家族对TAM、Bufalin/TRAIL诱导凋亡的调控　　 Western blot分析显示TAM作用于MCF-7细胞后c-Cb1的表达上调。采用LipofectamineTM2000瞬时转染野生型c-Cbl和c-Cbl的负性突变体70Z/Cbl后,流式分析结果显示“过表达”c-Cb1后,细胞对TAM的敏感性上调。70Z/Cb1抑制c-Cb1的泛素连接酶功能后细胞对TAM的敏感性下调。在Bufalin作用于MCF-7及MDA-MB-231细胞后,Western blot分析显示c-Cb1的表达水平未见明显变化,Cb1-b的表达水平逐渐下调。进一步研究发现“沉默”Cb1-b的表达后,细胞对Bufalin与TRAIL联合诱导凋亡的敏感性明显上调。以上结果提示Bufalin通过下调Cb1-b的表达增强乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性。　　 7、Cb1家族调控TAM及Bufalin/TRAIL诱导凋亡的机制　　 为探讨c-Cb1调节MCF-7细胞对TAM敏感性的机制,我们检测了转染野生型c-Cb1及其负突变体70Z/Cb1后细胞存活通路的变化。Western blot分析显示,上调c-Cb1的表达水平可明显抑制基础及TAM诱导的c-Src、ERK、AKT的活性,抑制c-Cb1的泛素连接酶功能可解除对c-Src、ERK、AKT活性的抑制作用。　　 为探讨Bufalin作用后DR4/DR5表达变化的机制,我们检测了“沉默”Cb1-b后DR4/DR5表达的变化。Western blot分析显示“沉默”Cb1-b后提高了Bufalin诱导的DR4/DR5上调幅度,进一步研究发现Cbl-b的下调解除了其对ERK、JNK、p38活性的抑制,进而导致了DR4/DR5上调。　　 结论：　　 1.TAM以时间和剂量依赖的方式抑制乳腺癌MCF-7增殖,诱导细胞凋亡。　　 2.c-Sre、ERK及AKT在TAM诱导MCF-7细胞凋亡过程中发挥了保护性作用。　　 3.乳腺癌MCF-7及MDA-MB-231细胞均对TRAIL耐药,Bufalin可明显增强乳腺癌细胞对TRAIL敏感性。　　 4.Bufalin通过上调死亡受体DR4/DR5的表达水平增强乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性。　　 5.Bufalin通过活化MAPKs(ERK、JNK、p38)信号的活性上调DR4/DR5的表达。　　 6.TAM通过上调c-Cb1的表达抑制细胞存活通路的活性诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡,Bufalin通过下调Cb1-b的表达,上调MAPKs信号的活性,继而导致DR4/DR5的上调,增强了乳腺癌细胞对TRAIL的敏感性。