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毛细管电泳是一种新兴的分离分析方法,是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展。由于毛细管电泳具有高效、快速、分离模式多、样品消耗量少、应用领域广、环境污染小等优点,使它成为生物化学和分析化学中最受瞩目、发展最快的一种分离分析新技术。毛细管电泳在生命科学、医学诊断和环境分析等众多领域都展示了广阔的应用前景。
我们选取了毛细管电泳研究中几个有代表性的问题,如分离、富集以及识别开展了相应的研究工作。
1.以磺酸基杯[4]芳烃为选择剂分离酚类位置异构体以对磺酸基杯[4]芳烃为选择剂研究了氯酚、甲酚、硝基酚和苯二酚位置异构体的毛细管电泳分离。采用部分填充技术避免了杯芳烃的紫外检测干扰。系统优化了缓冲溶液、分离电压、选择剂的浓度、选择剂区带的塞长等条件参数。其中分离甲酚、苯二酚和氯酚异构体的选择剂最优浓度和塞长分别为40mM30.6cmSCX4,40mM30.6cmSCX4和20mM25.5cmSCX4。对硝基酚而言,2mMSCX4就能使它的出峰顺序发生改变。定量分析结果显示,酚类异构体的质量检测限在0.07-0.28pg范围内,使用部分填充技术所得到的质量检测限比将杯芳烃用作缓冲溶液添加剂时低两个数量级。另外,用溶解度和分子模拟解释了杯芳烃与酚类异构体的相互作用。其中,硝基酚和氯酚与杯芳烃的相互作用主要是疏水作用,而苯二酚和甲酚与杯芳烃的相互作用以CH/π和OH/π相互作用为主。
2.以血清白蛋白为选择剂分离手性药物利用亲和毛细管电泳并结合部分填充技术,以人血清白蛋白和猪血清白蛋白(HSA,PSA)为手性选择剂,建立了一种有效拆分美西律、普萘洛尔、扑尔敏光学异构体的方法。系统地优化了影响手性分离的条件,在pH7.4磷酸盐缓冲体1系中分别以HSA和PSA为选择剂,实现了这三种碱性药物的手性分离。比较了HSA和PSA对三种药物的手性识别能力,其中,猪血清白蛋白对扑尔敏和普萘洛尔的手性识别能力较人血清白蛋白的强,而后者对美西律的识别能力较强。另外还测定了手性对映体与血清白蛋白相互作用的结合常数。本方法具有简单、快速、试剂消耗量小和能有效避免蛋白质检测干扰等优点。
3.药物-蛋白质相互作用的毛细管电泳研究采用亲合毛细管电泳并结合部分填充技术成功地测定了八个碱性药物与血清白蛋白相互作用的结合常数。同时,用分子模拟和多元回归分析研究了结合常数与药物的特征参数之间的定量结构-活性关系,并用来推测相互作用类型。其中,磺胺甲噁唑与人血清白蛋白的相互作用以静电作用为主,而其余的药物与人血清白蛋白的作用主要是疏水作用。
4.手性毛细管电泳研究蛋白质的构象变化通过人血清白蛋白与手性药物美西律的相互作用,用手性毛细管电泳研究了人血清白蛋白的构象变化。详细地研究了由pH、热、有机变性剂、剧烈振荡所引起的蛋白质构象改变对其手性选择性的影响,从而得出蛋白质构象变化的某些特征。此方法为研究蛋白质的构象变化以及蛋白质与药物的相互作用提供了一种简单、辅助的手段。方法简单、快速、试剂消耗量小,无需对商品毛细管电泳仪进行改造。通过本实验可以得到HSA构象变化的以下特征:
(1)HSA可以与手性药物对映体可逆结合,它们的相互作用主要是疏水作用。
(2)超声诱导的HSA构象转变是不可逆的,而pH诱导的构象转变在pH2.0-11.0范围内是可逆的。在pH7.4时,HSA具有最紧密的结构。
(3)热诱导的HSA构象转变是一个快的动力学过程。HSA在60℃附近发生了构象的突变。HSA在60℃以下的构象转变是可逆的,而在70℃以上的构象转变是不可逆的。
5.衍生化单糖的在线预富集采用一种简单、灵敏的在线预富集技术(阴离子选择性耗尽进样-扫集-胶2束电动色谱,ASEI-sweeping-MEKC)来提高衍生化单糖的检测灵敏度。两种单糖(木糖和鼠李糖)用8-氨基芘-1,3,6三磺酸(APTS)为衍生试剂进行柱前衍生。衍生化的单糖用ASEI-sweeping-MEKC法预富集,然后按胶束电动色谱模式进行分离,并用激光诱导荧光检测。这种方法的富集效率高达4500倍(基于峰高)。木糖和鼠李糖的检测限(S/N=3)低达3.8×10-13和2.1×10-13mol/L。另外,还比较了ASEI-sweeping-MEKC和场放大样品堆积(field-amplifiedsamplestacking,FASS)两种预富集方法的富集效率,在APTS衍生化单糖的分析中,前者的富集效率是后者的两倍。ASEI-sweeping-MEKC预富集方法是一种高效的富集技术,非常适合于样品中痕量和超痕量组分的分离分析。